Metabolitët imunomodulues janë një tipar kyç i mikroambientit të tumorit (TME), por me disa përjashtime, identitetet e tyre mbeten kryesisht të panjohura. Këtu, ne analizuam tumoret dhe qelizat T nga tumoret dhe ascitet e pacientëve me karcinomë seroze të gradës së lartë (HGSC) për të zbuluar metabolomin e këtyre ndarjeve të ndryshme TME. Ascitet dhe qelizat tumorale kanë dallime të gjera në metabolite. Krahasuar me ascitet, qelizat T që infiltrojnë tumorin janë të pasuruara ndjeshëm me 1-metilnikotinamid (MNA). Megjithëse niveli i MNA në qelizat T është i ngritur, shprehja e nikotinamid N-metiltransferazës (një enzimë që katalizon transferimin e grupeve metil nga S-adenozilmetionina në nikotinamid) është e kufizuar në fibroblaste dhe qeliza tumorale. Funksionalisht, MNA nxit qelizat T të sekretojnë faktorin alfa të nekrozës tumorale që nxit tumorin. Prandaj, MNA e derivuar nga TME kontribuon në rregullimin imunitar të qelizave T dhe përfaqëson një objektiv të mundshëm imunoterapie për trajtimin e kancerit njerëzor.
Metabolitët e derivuar nga tumori mund të kenë një efekt të thellë frenues në imunitetin anti-tumor, dhe gjithnjë e më shumë prova tregojnë se ato mund të shërbejnë gjithashtu si një forcë kryesore lëvizëse për përparimin e sëmundjes (1). Përveç efektit Warburg, puna e kohëve të fundit ka filluar të karakterizojë gjendjen metabolike të qelizave tumorale dhe marrëdhënien e saj me gjendjen imunitare të mikroambientit të tumorit (TME). Studimet mbi modelet e miut dhe qelizat T njerëzore kanë treguar se metabolizmi i glutaminës (2), metabolizmi oksidativ (3) dhe metabolizmi i glukozës (4) mund të veprojnë në mënyrë të pavarur në nëngrupe të ndryshme të qelizave imune. Disa metabolite në këto rrugë pengojnë funksionin anti-tumor të qelizave T. Është vërtetuar se bllokimi i koenzimës tetrahidrobiopterin (BH4) mund të dëmtojë përhapjen e qelizave T, dhe rritja e BH4 në trup mund të rrisë përgjigjen imunitare anti-tumor të ndërmjetësuar nga CD4 dhe CD8. Përveç kësaj, efekti imunosupresiv i kynureninës mund të shpëtohet nga administrimi i BH4 (5). Në glioblastomën mutante të izocitrat dehidrogjenazës (IDH), sekretimi i enantiometabolike (R)-2-hidroksiglutarat (R-2-HG) pengon aktivizimin, përhapjen dhe aktivitetin e citolizës së qelizave T (6). Kohët e fundit, është treguar se metilglioksali, një nënprodukt i glikolizës, prodhohet nga qelizat shtypëse me origjinë mieloide, dhe transferimi i metilglioksalit në qelizat T mund të pengojë funksionin e qelizave efektore T. Në trajtim, neutralizimi i metilglioksalit mund të kapërcejë aktivitetin e qelizave shtypëse të derivuara nga mieloide (MDSC) dhe të përmirësojë në mënyrë sinergjike terapinë e bllokimit të pikave të kontrollit në modelet e minjve (7). Këto studime së bashku theksojnë rolin kyç të metabolitëve të derivuar nga TME në rregullimin e funksionit dhe aktivitetit të qelizave T.
Mosfunksionimi i qelizave T është raportuar gjerësisht në kancerin ovarian (8). Kjo është pjesërisht për shkak të karakteristikave metabolike të natyrshme në hipoksi dhe enëve të gjakut jonormale të tumorit (9), të cilat rezultojnë në shndërrimin e glukozës dhe triptofanit në nënprodukte të tilla si acidi laktik dhe kynurenina. Laktati i tepërt jashtëqelizor zvogëlon prodhimin e interferonit-γ (IFN-γ) dhe nxit diferencimin e nëngrupeve mielosupresive (10, 11). Konsumi i triptofanit pengon drejtpërdrejt përhapjen e qelizave T dhe pengon sinjalizimin e receptorëve të qelizave T (12-14). Pavarësisht këtyre vëzhgimeve, shumë punë rreth metabolizmit imunitar u krye në kulturën e qelizave T in vitro duke përdorur media të optimizuara, ose u kufizua në modele homologe të miut in vivo, asnjëra prej të cilave nuk pasqyron plotësisht heterogjenitetin e kancereve njerëzore dhe makro dhe mikro mjedisit fiziologjik.
Një tipar i zakonshëm i kancerit ovarian është përhapja peritoneale dhe shfaqja e ascitit. Akumulimi i lëngut qelizor në ascit shoqërohet me sëmundje të avancuar dhe prognozë të dobët (15). Sipas raporteve, kjo ndarje unike është hipoksike, ka nivele të larta të faktorit të rritjes endoteliale vaskulare (VEGF) dhe indoleaminë 2,3-dioksigjenazës (IDO), dhe është e infiltruar nga qelizat rregullatore T dhe qelizat frenuese mieloide (15-18). Mjedisi metabolik i ascitit mund të jetë i ndryshëm nga ai i vetë tumorit, kështu që riprogramimi i qelizave T në hapësirën peritoneale është i paqartë. Përveç kësaj, ndryshimet kryesore dhe heterogjeniteti midis ascitit dhe metabolitëve të pranishëm në mjedisin e tumorit mund të pengojnë infiltrimin e qelizave imune dhe funksionin e tyre në tumore, dhe nevojiten kërkime të mëtejshme.
Për të zgjidhur këto probleme, ne hartuam një metodë të ndjeshme të ndarjes së qelizave dhe kromatografisë së lëngshme me spektrometri masive në tandem (LC-MS/MS) për të studiuar lloje të ndryshme qelizash (duke përfshirë qelizat T CD4 + dhe CD8 +), si dhe brenda dhe midis tumoreve. Metabolitët e saj shtrihen në qelizat në të njëjtin mjedis asciti dhe tumori të pacientit. Ne e përdorim këtë metodë në lidhje me citometrinë e rrjedhës me dimensione të larta dhe sekuencimin e ARN-së me një qelizë të vetme (scRNA-seq) për të ofruar një portret shumë të zgjidhur të statusit metabolik të këtyre popullatave kryesore. Kjo metodë zbuloi një rritje të konsiderueshme të nivelit të 1-metilnikotinamidit (MNA) në qelizat T të tumorit, dhe eksperimentet in vitro treguan se efekti imunomodulues i MNA-së në funksionin e qelizave T ishte i panjohur më parë. Në përgjithësi, kjo metodë zbulon ndërveprimet e ndërsjella metabolike midis tumoreve dhe qelizave imune, dhe ofron njohuri unike mbi metabolitët e rregullimit imunitar, të cilat mund të jenë të dobishme për trajtimin e imunoterapisë së kancerit ovarian të bazuar në qelizat T. Mundësitë e trajtimit.
Ne përdorëm citometri rrjedhëse me dimensione të larta për të përcaktuar njëkohësisht sasinë e thithjes së glukozës [2-(N-(7-nitrofenil-2-oksa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-deoksiglukozë (2-NBDG) dhe aktivitetit mitokondrial [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) janë shënjues tipikë krah për krah që dallojnë qelizat imune dhe popullatat e qelizave tumorale (Tabela S2 dhe Figura S1A). Kjo analizë tregoi se krahasuar me qelizat T, ascitet dhe qelizat tumorale kanë nivele më të larta të thithjes së glukozës, por kanë ndryshime më të vogla në aktivitetin mitokondrial. Thithja mesatare e glukozës nga qelizat tumorale [CD45-EpCAM (EpCAM)+] është tre deri në katër herë më e lartë se ajo e qelizave T, dhe thithja mesatare e glukozës nga qelizat T CD4+ është 1.2 herë më e lartë se ajo e qelizave T CD8+, gjë që tregon se limfocitet infiltruese tumorale (TIL) kanë kërkesa të ndryshme metabolike edhe në të njëjtën TME (Figura 1A). Në të kundërt, aktiviteti mitokondrial në qelizat tumorale është i ngjashëm me atë të qelizave CD4 + T, dhe aktiviteti mitokondrial i të dy llojeve të qelizave është më i lartë se ai i qelizave CD8 + T (Figura 1B). Në përgjithësi, këto rezultate zbulojnë nivelin metabolik. Aktiviteti metabolik i qelizave tumorale është më i lartë se ai i qelizave CD4 + T, dhe aktiviteti metabolik i qelizave CD4 + T është më i lartë se ai i qelizave CD8 + T. Pavarësisht këtyre efekteve në të gjitha llojet e qelizave, nuk ka ndonjë ndryshim të qëndrueshëm në gjendjen metabolike të qelizave CD4 + dhe CD8 + T ose në përpjesëtimet e tyre relative në ascit krahasuar me tumoret (Figura 1C). Në të kundërt, në fraksionin e qelizave CD45, përpjesëtimi i qelizave EpCAM+ në tumor u rrit krahasuar me ascitin (Figura 1D). Ne gjithashtu vumë re një ndryshim të qartë metabolik midis përbërësve të qelizave EpCAM+ dhe EpCAM-. Qelizat EpCAM+ (tumorale) kanë thithje më të lartë të glukozës dhe aktivitet mitokondrial sesa qelizat EpCAM-, i cili është shumë më i lartë se aktiviteti metabolik i fibroblasteve në qelizat tumorale në TME (Figura 1, E dhe F).
(A dhe B) Intensiteti mesatar i fluoreshencës (MFI) i thithjes së glukozës (2-NBDG) (A) dhe aktiviteti mitokondrial i qelizave T CD4 + (MitoTracker e kuqe e errët) (B) Grafikët përfaqësues (majtas) dhe të dhënat e tabeluara (Djathtas), qelizat T CD8 + dhe qelizat tumorale EpCAM + CD45 nga asciti dhe tumori. (C) Raporti i qelizave CD4 + dhe CD8 + (i qelizave T CD3 +) në ascit dhe tumor. (D) Përqindja e qelizave tumorale EpCAM + në ascit dhe tumor (CD45−). (E dhe F) Thithja e glukozës nga tumori EpCAM + CD45 dhe matrica EpCAM-CD45 (2-NBDG) (E) dhe aktiviteti mitokondrial (MitoTracker e kuqe e errët) (F) grafikët përfaqësues (majtas) dhe të dhënat e tabeluara (Djathtas) Ascitet dhe qelizat tumorale. (G) Grafikët përfaqësues të shprehjes së CD25, CD137 dhe PD1 me anë të citometrisë me rrjedhje. (H dhe I) Shprehja e CD25, CD137 dhe PD1 në qelizat T CD4 + (H) dhe qelizat T CD8 + (I). (J dhe K) Fenotipet naive, të memories qendrore (Tcm), efektore (Teff) dhe të memories efektore (Tem) bazuar në shprehjen e CCR7 dhe CD45RO. Imazhe përfaqësuese (majtas) dhe të dhëna tabelare (djathtas) të qelizave T CD4 + (J) dhe qelizave T CD8 + (K) në ascit dhe tumore. Vlerat P ​​të përcaktuara nga testi t i çiftëzuar (*P<0.05, **P<0.01 dhe ***P<0.001). Vija përfaqëson pacientët e përputhur (n = 6). FMO, fluoreshenca minus një; MFI, intensiteti mesatar i fluoreshencës.
Analiza e mëtejshme zbuloi dallime të tjera të rëndësishme midis statusit fenotipik të qelizave T me zgjidhje të lartë. Kujtesa e aktivizuar (Figura 1, G deri në I) dhe efektore (Figura 1, J dhe K) në tumore është shumë më e shpeshtë se asciti (përqindja e qelizave T CD3 +). Në mënyrë të ngjashme, analiza e fenotipit nga shprehja e shënuesve të aktivizimit (CD25 dhe CD137) dhe shënuesve të varfërimit [proteina e vdekjes qelizore e programuar 1 (PD1)] tregoi se megjithëse karakteristikat metabolike të këtyre popullatave janë të ndryshme (Figura S1, B deri në E), nuk u vunë re vazhdimisht dallime të rëndësishme metabolike midis nëngrupeve naive, efektore ose të kujtesës (Figura S1, F deri në I). Këto rezultate u konfirmuan duke përdorur metoda të të mësuarit automatik për të caktuar automatikisht fenotipet e qelizave (21), të cilat zbuluan më tej praninë e një numri të madh të qelizave të palcës së kockave (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) në ascitin e pacientit (Figura S2A). Midis të gjitha llojeve të qelizave të identifikuara, kjo popullatë qelizash mieloide tregoi thithjen më të lartë të glukozës dhe aktivitetin mitokondrial (Figura S2, B deri në G). Këto rezultate nxjerrin në pah ndryshimet e forta metabolike midis llojeve të shumta të qelizave të gjetura në ascit dhe tumore tek pacientët me HGSC.
Sfida kryesore në kuptimin e karakteristikave metabonomike të TIL është nevoja për të izoluar mostrat e qelizave T me pastërti, cilësi dhe sasi të mjaftueshme nga tumoret. Studimet e fundit kanë treguar se metodat e renditjes dhe pasurimit me sfera bazuar në citometrinë e rrjedhës mund të çojnë në ndryshime në profilet e metabolitëve qelizorë (22-24). Për të kapërcyer këtë problem, ne optimizuam metodën e pasurimit me sfera për të izoluar dhe izoluar TIL nga kanceri ovarian i njeriut i rezektuar kirurgjikalisht para analizës me LC-MS/MS (shih Materialet dhe Metodat; Figura 2A). Për të vlerësuar ndikimin e përgjithshëm të këtij protokolli në ndryshimet e metabolitëve, ne krahasuam profilet e metabolitëve të qelizave T të aktivizuara nga donatorë të shëndetshëm pas hapit të mësipërm të ndarjes së sferave me qelizat që nuk u ndanë me sfera, por mbetën në akull. Kjo analizë e kontrollit të cilësisë zbuloi se ekziston një korrelacion i lartë midis këtyre dy kushteve (r = 0.77), dhe përsëritshmëria teknike e grupit prej 86 metabolitësh ka përsëritshmëri të lartë (Figura 2B). Prandaj, këto metoda mund të kryejnë analizë të saktë të metabolitëve në qelizat që i nënshtrohen pasurimit të tipit qelizor, duke siguruar kështu platformën e parë me rezolucion të lartë për identifikimin e metabolitëve specifikë në HGSC, duke u mundësuar kështu njerëzve të fitojnë një kuptim më të thellë të programit të metabolizmit seksual specifik të qelizave.
(A) Diagrama skematike e pasurimit me sfera magnetike. Para analizës me LC-MS/MS, qelizat do t'i nënshtrohen tre raundeve të njëpasnjëshme të pasurimit me sfera magnetike ose do të mbeten në akull. (B) Efekti i llojit të pasurimit në bollëkun e metabolitëve. Mesatarja e tre matjeve për secilin lloj pasurimi ± SE. Vija gri përfaqëson një marrëdhënie 1:1. Korrelacioni brenda klasës (ICC) i matjeve të përsëritura të treguara në etiketën e boshtit. NAD, nikotinamid adenin dinukleotid. (C) Diagrama skematike e rrjedhës së punës së analizës së metabolitëve të pacientit. Ascitet ose tumoret mblidhen nga pacientët dhe kriokonservohen. Një pjesë e vogël e secilës mostër u analizua me citometri rrjedhëse, ndërsa mostrat e mbetura iu nënshtruan tre raundeve të pasurimit për qelizat CD4+, CD8+ dhe CD45-. Këto fraksione qelizore u analizuan duke përdorur LC-MS/MS. (D) Harta e nxehtësisë e bollëkut të standardizuar të metabolitëve. Dendrograma përfaqëson grupimin e distancave Euklidiane të Ward midis mostrave. (E) Analiza e komponentëve kryesorë (PCA) e hartës së metabolitëve të mostrës, që tregon tre replikime të secilës mostër, mostrat nga i njëjti pacient janë të lidhura me një vijë. (F) PCA e profilit të metabolitëve të mostrës e kushtëzuar nga pacienti (p.sh., duke përdorur redundancë të pjesshme); lloji i mostrës është i kufizuar nga forma konvekse. PC1, komponenti kryesor 1; PC2, komponenti kryesor 2.
Më pas, ne aplikuam këtë metodë pasurimi për të analizuar 99 metabolitë në fraksionet e qelizave CD4 +, CD8 + dhe CD45 në ascitin primar dhe tumoret e gjashtë pacientëve me HGSC (Figura 2C, Figura S3A dhe Tabela S3 dhe S4). Popullata me interes përbën 2% deri në 70% të mostrës origjinale të madhe të qelizave të gjalla, dhe përqindja e qelizave ndryshon shumë midis pacientëve. Pas ndarjes së sferave, fraksioni i pasuruar me interes (CD4+, CD8+ ose CD45-) përbën mesatarisht më shumë se 85% të të gjitha qelizave të gjalla në mostër. Kjo metodë pasurimi na lejon të analizojmë popullatat e qelizave nga metabolizmi i indeve tumorale njerëzore, gjë që është e pamundur të bëhet nga mostrat e mëdha. Duke përdorur këtë protokoll, ne përcaktuam se l-kynurenina dhe adenozina, këto dy metabolitë imunosupresive të karakterizuara mirë, ishin të ngritura në qelizat T tumorale ose qelizat tumorale (Figura S3, B dhe C). Prandaj, këto rezultate demonstrojnë besnikërinë dhe aftësinë e teknologjisë sonë të ndarjes së qelizave dhe spektrometrisë së masës për të gjetur metabolitë biologjikisht të rëndësishëm në indet e pacientëve.
Analiza jonë zbuloi gjithashtu një ndarje të fortë metabolike të llojeve të qelizave brenda dhe midis pacientëve (Figura 2D dhe Figura S4A). Në veçanti, krahasuar me pacientët e tjerë, pacienti 70 tregoi karakteristika të ndryshme metabolike (Figura 2E dhe Figura S4B), duke treguar se mund të ketë heterogjenitet të konsiderueshëm metabolik midis pacientëve. Vlen të përmendet se krahasuar me pacientët e tjerë (1.2 deri në 2 litra; Tabela S1), sasia totale e ascitit të mbledhur te pacienti 70 (80 ml) ishte më e vogël. Kontrolli i heterogjenitetit midis pacientëve gjatë analizës së komponentëve kryesorë (për shembull, duke përdorur analizën e tepricës së pjesshme) tregon ndryshime të qëndrueshme midis llojeve të qelizave, dhe llojet e qelizave dhe/ose mikroambienti janë qartë të agreguara sipas profilit të metabolitit (Figura 2F). Analiza e metabolitëve të vetëm theksoi këto efekte dhe zbuloi dallime të rëndësishme midis llojeve të qelizave dhe mikroambientit. Vlen të përmendet se ndryshimi më ekstrem i vërejtur është MNA, e cila zakonisht është e pasuruar me qeliza CD45- dhe me qeliza CD4+ dhe CD8+ që infiltrojnë tumorin (Figura 3A). Për qelizat CD4+, ky efekt është më i dukshëm, dhe MNA në qelizat CD8+ gjithashtu duket se ndikohet fuqishëm nga mjedisi. Megjithatë, kjo nuk është e rëndësishme, sepse vetëm tre nga gjashtë pacientët mund të vlerësohen për rezultatet e tumorit CD8+. Përveç MNA-së, në lloje të ndryshme qelizash në ascit dhe tumore, metabolite të tjerë që karakterizohen dobët në TIL janë gjithashtu të pasur në mënyrë të ndryshme (Figurat S3 dhe S4). Prandaj, këto të dhëna zbulojnë një grup premtues të metabolitëve imunomodulues për kërkime të mëtejshme.
(A) Përmbajtje e normalizuar e MNA-së në qelizat CD4+, CD8+ dhe CD45- nga asciti dhe tumori. Grafiku i kutisë tregon medianën (vijën), diapazonin ndërkuartil (vargu i kornizës) dhe diapazonin e të dhënave, deri në 1.5 herë diapazonin ndërkuartil (mustaq i kornizës). Siç përshkruhet në Materialet dhe Metodat e Pacientit, përdorni vlerën limma të pacientit për të përcaktuar vlerën P (*P<0.05 dhe **P<0.01). (B) Diagrama skematike e metabolizmit të MNA-së (60). Metabolitët: S-adenosil-1-metioninë; SAH, S-adenosinë-1-homocisteinë; NA, nikotinamid; MNA, 1-metilnikotinamid; 2-PY, 1-metil-2-piridon-5-karboksamid; 4-PY, 1-metil-4-piridon-5-karboksamid; NR, nikotinamid ribozë; NMN, nikotinamid mononukleotid. Enzimat (jeshile): NNMT, nikotinamide N-metiltransferaza; SIRT, sirtuina; NAMPT, nikotinamide fosforibozil transferaza; AOX1, aldehide oksidaza 1; NRK, nikotinamide ribozid kinaza; NMNAT, mono nikotinamide nukleotide adenilate transferaza; Pnp1, nukleozid purine fosforilaza. (C) t-SNE e scRNA-seq të ascites (gri) dhe tumorit (e kuqe; n = 3 pacientë). (D) Shprehja e NNMT në popullata të ndryshme qelizash të identifikuara duke përdorur scRNA-seq. (E) Shprehja e NNMT dhe AOX1 në SK-OV-3, veshkë embrionale njerëzore (HEK) 293T, qelizat T dhe qelizat T të trajtuara me MNA. Shprehja e palosur tregohet në krahasim me SK-OV-3. Tregohet modeli i shprehjes me SEM (n = 6 donatorë të shëndetshëm). Vlerat Ct më të mëdha se 35 konsiderohen të pazbulueshme (UD). (F) Shprehja e SLC22A1 dhe SLC22A2 në qelizat T SK-OV-3, HEK293T, dhe qelizat T të trajtuara me 8mM MNA. Shprehja e palosur tregohet në krahasim me SK-OV-3. Modeli i shprehjes me SEM tregohet (n = 6 donatorë të shëndetshëm). Vlerat Ct më të mëdha se 35 konsiderohen të pazbulueshme (UD). (G) Përmbajtja e MNA qelizore në qelizat T të donatorëve të shëndetshëm të aktivizuar pas 72 orësh inkubimi me MNA. Modeli i shprehjes me SEM tregohet (n = 4 donatorë të shëndetshëm).
MNA prodhohet duke transferuar grupin metil nga S-adenosil-1-metionina (SAM) në nikotinamid (NA) nga nikotinamid N-metiltransferaza (NNMT; Figura 3B). NNMT shprehet tepër në një sërë kanceresh njerëzore dhe shoqërohet me përhapje, pushtim dhe metastazë (25-27). Për të kuptuar më mirë burimin e MNA në qelizat T në TME, ne përdorëm scRNA-seq për të karakterizuar shprehjen e NNMT në të gjitha llojet e qelizave në ascit dhe tumore të tre pacientëve me HGSC (Tabela S5). Analiza e afërsisht 6,500 qelizave tregoi se në ascit dhe mjedise tumorale, shprehja e NNMT ishte e kufizuar në popullatat e supozuara të fibroblasteve dhe qelizave tumorale (Figura 3, C dhe D). Vlen të përmendet se nuk ka shprehje të dukshme të NNMT në asnjë popullatë që shpreh PTPRC (CD45 +) (Figura 3D dhe Figura S5A), gjë që tregon se MNA e zbuluar në spektrin e metabolitëve është futur në qelizat T. Shprehja e aldehid oksidazës 1 (AOX1) e shndërron MNA-në në 1-metil-2-piridon-5-karboksamidë (2-PYR) ose 1-metil-4-piridon-5-karboksamidë (4-PYR); Figura 3B) është gjithashtu e kufizuar në popullatën e fibroblasteve që shprehin COL1A1 (Figura S5A), të cilat së bashku tregojnë se qelizat T nuk kanë aftësinë e metabolizmit konvencional të MNA-së. Modeli i shprehjes së këtyre gjeneve të lidhura me MNA-në u verifikua duke përdorur një grup të dytë të të dhënave të pavarura qelizore nga asciti nga pacientët me HGSC (Figura S5B; n = 6) (16). Përveç kësaj, analiza sasiore e reaksionit zinxhir të polimerazës (qPCR) të qelizave T të dhurueseve të shëndetshme të trajtuara me MNA tregoi se krahasuar me qelizat tumorale ovariane SK-OV-3 të kontrollit, NNMT ose AOX1 pothuajse nuk shprehej (Figura 3E). Këto rezultate të papritura tregojnë se MNA mund të sekretohet nga fibroblastet ose tumoret në qelizat T ngjitur në TME.
Edhe pse kandidatët përfshijnë familjen e transportuesve të kationeve organike 1 deri në 3 (OCT1, OCT2 dhe OCT3) të koduar nga familja e transportuesve të tretshëm 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 dhe SLC22A3), transportuesit e mundshëm të MNA janë ende të papërcaktuar (28). QPCR e mRNA-së nga qelizat T të dhuruesve të shëndetshëm tregoi nivele të ulëta shprehjeje të SLC22A1, por nivele të pazbulueshme të SLC22A2, gjë që konfirmoi se ishte raportuar më parë në literaturë (Figura 3F) (29). Në të kundërt, linja qelizore e tumorit ovarian SK-OV-3 shprehu nivele të larta të të dy transportuesve (Figura 3F).
Për të testuar mundësinë e qelizave T që kanë aftësinë për të thithur MNA të huaj, qelizat T të dhuruara të shëndetshme u kultivuan për 72 orë në prani të përqendrimeve të ndryshme të MNA-së. Në mungesë të MNA-së ekzogjene, përmbajtja qelizore e MNA-së nuk mund të zbulohet (Figura 3G). Megjithatë, qelizat T të aktivizuara të trajtuara me MNA ekzogjene treguan një rritje të varur nga doza në përmbajtjen e MNA-së në qeliza, deri në 6 mM MNA (Figura 3G). Ky rezultat tregon se pavarësisht nivelit të ulët të shprehjes së transportuesit dhe mungesës së enzimës kryesore përgjegjëse për metabolizmin intraqelizor të MNA-së, TIL ende mund ta thithë MNA-në.
Spektri i metabolitëve në qelizat T të pacientëve dhe eksperimentet e thithjes së MNA-së in vitro rrisin mundësinë që fibroblastet e shoqëruara me kancerin (CAF) të sekretojnë MNA dhe qelizat tumorale mund të rregullojnë fenotipin dhe funksionin e TIL. Për të përcaktuar efektin e MNA-së në qelizat T, qelizat T të dhuruara të shëndetshme u aktivizuan in vitro në prani ose mungesë të MNA-së, dhe u vlerësua përhapja dhe prodhimi i tyre i citokinës. Pas 7 ditësh nga shtimi i MNA-së në dozën më të lartë, numri i dyfishimit të popullatës u zvogëlua në mënyrë të moderuar, ndërsa energjia u ruajt në të gjitha dozat (Figura 4A). Përveç kësaj, trajtimi i MNA-së ekzogjene rezultoi në një rritje të proporcionit të qelizave T CD4 + dhe CD8 + që shprehin faktorin e nekrozës tumorale-α (TNFα; Figura 4B). Në të kundërt, prodhimi intraqelizor i IFN-γ u zvogëlua ndjeshëm në qelizat T CD4 +, por jo në qelizat T CD8 +, dhe nuk pati ndonjë ndryshim të rëndësishëm në interleukinën 2 (IL-2; Figura 4, C dhe D). Prandaj, analiza imunosorbentike e lidhur me enzimën (ELISA) e supernatanteve nga këto kultura të qelizave T të trajtuara me MNA tregoi një rritje të konsiderueshme të TNFα, një ulje të IFN-γ dhe asnjë ndryshim në IL-2 (Figura 4, E në G). . Ulja e IFN-γ tregon se MNA mund të luajë një rol në frenimin e aktivitetit antitumor të qelizave T. Për të simuluar efektin e MNA në citotoksicitetin e ndërmjetësuar nga qelizat T, qelizat T të receptorit të antigjenit kimerik (FRα-CAR-T) që synojnë receptorin α të folatit dhe qelizat CAR-T (GFP) të rregulluara nga qelizat e proteinave fluoreshente jeshile (GFP) -CAR-T) prodhohen nga qelizat mononukleare të gjakut periferik (PBMC) të donatorëve të shëndetshëm. Qelizat CAR-T u kultivuan për 24 orë në prani të MNA dhe më pas u bashkë-kultivuan me qeliza tumorale ovariane SK-OV-3 njerëzore që shprehin receptorin α të folatit në një raport efektor ndaj objektivit prej 10:1. Trajtimi me MNA rezultoi në një rënie të ndjeshme të aktivitetit vrasës të qelizave FRα-CAR-T, i cili ishte i ngjashëm me qelizat FRα-CAR-T të trajtuara me adenozinë (Figura 4H).
(A) Numri total i qelizave të gjalla dhe dyfishimi i popullatës (PD) direkt nga kultura në ditën e 7-të. Grafiku me shufra përfaqëson mesataren + SEM të gjashtë donatorëve të shëndetshëm. Përfaqëson të dhëna nga të paktën n = 3 eksperimente të pavarura. (B deri në D) CD3/CD28 dhe IL-2 u përdorën për të aktivizuar qelizat T në përqendrimet e tyre përkatëse të MNA për 7 ditë. Para analizës, qelizat u stimuluan me PMA/ionomicinë me GolgiStop për 4 orë. Shprehja e TNFα (B) në qelizat T. Imazh shembullor (majtas) dhe të dhëna tabelare (djathtas) të shprehjes së TNFα në qelizat e gjalla. Shprehja e IFN-γ (C) dhe IL-2 (D) në qelizat T. Shprehja e citokinave u mat me citometri rrjedhëse. Grafiku me shufra përfaqëson mesataren (n = 6 donatorë të shëndetshëm) + SEM. Përdorni analizën njëkahëshe të variancës dhe matjet e përsëritura (*P<0.05 dhe **P<0.01) për të përcaktuar vlerën P. Përfaqëson të dhëna nga të paktën n = 3 eksperimente të pavarura. (E deri në G) CD3/CD28 dhe IL-2 u përdorën për të aktivizuar qelizat T në përqendrimet e tyre përkatëse të MNA për 7 ditë. Mjedisi u mblodh para dhe pas 4 orësh stimulimi me PMA/ionomicinë. Përqendrimet e TNFα (E), IFN-γ (F) dhe IL-2 (G) u matën me ELISA. Grafiku me shufra përfaqëson mesataren (n = 5 donatorë të shëndetshëm) + SEM. Vlera P e përcaktuar duke përdorur analizën njëkahëshe të variancës dhe matje të përsëritura (*P<0.05). Vija me pika tregon kufirin e zbulimit të zbulimit. (H) Analiza e lizës së qelizave. Qelizat FRα-CAR-T ose GFP-CAR-T u rregulluan me adenozinë (250μM) ose MNA (10 mM) për 24 orë, ose u lanë të patrajtuara (Ctrl). U mat përqindja e vrasjes së qelizave SK-OV-3. Vlera P e përcaktuar me testin t Welch (*P<0.5 dhe **P<0.01).
Për të fituar një kuptim mekanik të rregullimit të shprehjes së TNFα të varur nga MNA, u vlerësuan ndryshimet në mRNA-në e TNFα të qelizave T të trajtuara me MNA (Figura 5A). Qelizat T të dhuruesve të shëndetshëm të trajtuar me MNA treguan një rritje dyfish të niveleve të transkriptimit të TNFα, duke treguar se MNA varet nga rregullimi transkriptues i TNFα. Për të hetuar këtë mekanizëm të mundshëm rregullator, u vlerësuan dy faktorë të njohur të transkriptimit që rregullojnë TNFα, përkatësisht faktori bërthamor i aktivizuar i qelizave T (NFAT) dhe proteina specifike 1 (Sp1), në përgjigje të lidhjes së MNA-së me promotorin proksimal të TNFα (30). Promotori i TNFα përmban 6 vende të identifikuara të lidhjes së NFAT dhe 2 vende të lidhjes së Sp1, që mbivendosen në një vend [-55 çifte bazash (bp) nga kapaku 5'] (30). Imunoprecipitimi i kromatinës (ChIP) tregoi se kur trajtohet me MNA, lidhja e Sp1 me promotorin e TNFα u rrit trefish. Përfshirja e NFAT gjithashtu u rrit dhe iu afrua rëndësisë (Figura 5B). Këto të dhëna tregojnë se MNA rregullon shprehjen e TNFα përmes transkriptimit të Sp1, dhe në një masë më të vogël shprehjen e NFAT.
(A) Krahasuar me qelizat T të kultivuara pa MNA, ndryshimi i shprehjes së TNFα në qelizat T të trajtuara me MNA. Modeli i shprehjes me SEM tregohet (n = 5 donatorë të shëndetshëm). Përfaqëson të dhëna nga të paktën n = 3 eksperimente të pavarura. (B) Promotori TNFα i qelizave T të trajtuara me ose pa 8 mM MNA pas NFAT dhe Sp1 u kombinua me (Ctrl) dhe stimulim PMA/ionomicinë për 4 orë. Imunoglobulina G (IgG) dhe H3 u përdorën si kontrolle negative dhe pozitive për imunoprecipitim, përkatësisht. Kuantifikimi i ChIP tregoi se lidhja e Sp1 dhe NFAT me promotorin TNFα në qelizat e trajtuara me MNA u rrit disa herë krahasuar me kontrollin. Përfaqëson të dhëna nga të paktën n = 3 eksperimente të pavarura. Vlera P e përcaktuar nga teste të shumëfishta t (*** P <0.01). (C) Krahasuar me ascitet e HGSC, qelizat T (jo-citotoksike) treguan shprehje të rritur të TNF në tumor. Ngjyrat përfaqësojnë pacientë të ndryshëm. Qelizat e shfaqura janë marrë rastësisht në 300 mostra dhe janë luhatur për të kufizuar mbingarkesën (** Padj = 0.0076). (D) Modeli i propozuar i MNA-së për kancerin ovarian. MNA prodhohet në qelizat tumorale dhe fibroblastet në TME dhe merret nga qelizat T. MNA rrit lidhjen e Sp1 me promotorin TNFα, duke çuar në rritjen e transkriptimit të TNFα dhe prodhimin e citokinës TNFα. MNA gjithashtu shkakton një ulje të IFN-γ. Frenimi i funksionit të qelizave T çon në uljen e aftësisë vrasëse dhe përshpejtimin e rritjes së tumorit.
Sipas raporteve, TNFα ka efekte anti-tumorale dhe anti-tumorale të varura nga përpara dhe prapa, por ka një rol të njohur në nxitjen e rritjes dhe metastazës së kancerit ovarian (31-33). Sipas raporteve, përqendrimi i TNFα në ascit dhe indet tumorale tek pacientët me kancer ovarian është më i lartë se ai në indet beninje (34-36). Për sa i përket mekanizmit, TNFα mund të rregullojë aktivizimin, funksionin dhe përhapjen e qelizave të bardha të gjakut, dhe të ndryshojë fenotipin e qelizave kancerogjene (37, 38). Në përputhje me këto gjetje, analiza diferenciale e shprehjes së gjeneve tregoi se TNF ishte rritur ndjeshëm në qelizat T në indet tumorale krahasuar me ascitet (Figura 5C). Rritja e shprehjes së TNF ishte e dukshme vetëm në popullatat e qelizave T me një fenotip jo-citotoksik (Figura S5A). Në përmbledhje, këto të dhëna mbështesin pikëpamjen se MNA ka efekte të dyfishta imunosupresive dhe nxitëse të tumorit në HGSC.
Etiketimi fluoreshent bazuar në citometrinë e rrjedhës është bërë metoda kryesore për studimin e metabolizmit të TIL. Këto studime kanë treguar se krahasuar me limfocitet e gjakut periferik ose qelizat T nga organet limfoide sekondare, TIL miunë dhe njerëzorë kanë një tendencë më të lartë për të thithur glukozën (4, 39) dhe humbjen graduale të funksionit mitokondrial (19, 40). Megjithëse kemi vërejtur rezultate të ngjashme në këtë studim, zhvillimi kryesor është krahasimi i metabolizmit të qelizave tumorale dhe TIL nga i njëjti ind tumoral i rezektuar. Në përputhje me disa nga këto raporte të mëparshme, qelizat tumorale (CD45-EpCAM +) nga asciti dhe tumoret kanë thithje më të lartë të glukozës sesa qelizat T CD8 + dhe CD4 +, duke mbështetur që thithja e lartë e glukozës nga qelizat tumorale mund të krahasohet me qelizat T. Koncepti i konkurrencës së qelizave T. TME. Megjithatë, aktiviteti mitokondrial i qelizave tumorale është më i lartë se ai i qelizave T CD8 +, por aktiviteti mitokondrial është i ngjashëm me atë të qelizave T CD4 +. Këto rezultate përforcojnë temën në zhvillim se metabolizmi oksidativ është i rëndësishëm për qelizat tumorale (41, 42). Ata gjithashtu sugjerojnë që qelizat T CD8 + mund të jenë më të ndjeshme ndaj mosfunksionimit oksidativ sesa qelizat T CD4 +, ose që qelizat T CD4 + mund të përdorin burime karboni përveç glukozës për të ruajtur aktivitetin mitokondrial (43, 44). Duhet theksuar se nuk vumë re asnjë ndryshim në thithjen e glukozës ose aktivitetin mitokondrial midis efektorëve T CD4 +, kujtesës efektore T dhe qelizave të kujtesës qendrore T në ascit. Në mënyrë të ngjashme, gjendja e diferencimit të qelizave T CD8 + në tumore nuk ka të bëjë fare me ndryshimet në thithjen e glukozës, duke theksuar ndryshimin e rëndësishëm midis qelizave T të kultivuara in vitro dhe TIL njerëzore in vivo (22). Këto vëzhgime u konfirmuan gjithashtu nga përdorimi i ndarjes automatike të paanshme të popullatës qelizore, e cila zbuloi më tej se qelizat CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + me thithje më të lartë të glukozës dhe aktivitet mitokondrial sesa qelizat tumorale janë të përhapura, por kanë popullatë qelizash aktive metabolike. Kjo popullatë mund të përfaqësojë nënpopullatën e supozuar të qelizave shtypëse mieloide ose qelizave dendritike plazmacitoide të identifikuara në analizën scRNA-seq. Edhe pse të dyja këto janë raportuar në tumoret ovariane njerëzore [45], ato ende kanë nevojë për punë të mëtejshme për të përshkruar këtë nënpopullatë mieloide.
Edhe pse metodat e bazuara në citometrinë e rrjedhës mund të sqarojnë ndryshimet e përgjithshme në metabolizmin e glukozës dhe oksidativ midis llojeve të qelizave, metabolitët e saktë të prodhuar nga glukoza ose burime të tjera të karbonit për metabolizmin mitokondrial në TME ende nuk janë përcaktuar. Caktimi i pranisë ose mungesës së metabolitëve në një nëngrup të caktuar TIL kërkon pastrimin e popullatës qelizore nga indi i prerë. Prandaj, metoda jonë e pasurimit të qelizave e kombinuar me spektrometrinë masive mund të ofrojë njohuri mbi metabolitët që janë të pasuruar në mënyrë të ndryshme në qelizat T dhe popullatat e qelizave tumorale në mostrat e pacientëve që përputhen. Edhe pse kjo metodë ka avantazhe ndaj renditjes së qelizave të aktivizuara me fluoreshencë, disa biblioteka të metabolitëve mund të preken për shkak të stabilitetit të natyrshëm dhe/ose shkallës së shpejtë të qarkullimit (22). Megjithatë, metoda jonë ishte në gjendje të identifikonte dy metabolitë imunosupresivë të njohur, adenozinën dhe kynureninën, sepse ato ndryshojnë shumë midis llojeve të mostrave.
Analiza jonë metabonomike e tumoreve dhe nëntipeve TIL ofron më shumë njohuri mbi rolin e metabolitëve në TME ovariane. Së pari, duke përdorur citometrinë e rrjedhës, ne përcaktuam se nuk kishte ndryshim në aktivitetin mitokondrial midis tumoreve dhe qelizave T CD4 +. Megjithatë, analiza LC-MS/MS zbuloi ndryshime të rëndësishme në bollëkun e metabolitëve midis këtyre popullatave, duke treguar se përfundimet rreth metabolizmit të TIL dhe aktivitetit të tij të përgjithshëm metabolik kërkojnë interpretim të kujdesshëm. Së dyti, MNA është metaboliti me ndryshimin më të madh midis qelizave CD45 dhe qelizave T në ascit, jo në tumore. Prandaj, ndarjet dhe vendndodhja e tumorit mund të kenë efekte të ndryshme në metabolizmin e TIL, gjë që nxjerr në pah heterogjenitetin e mundshëm në një mikroambient të caktuar. Së treti, shprehja e enzimës NNMT që prodhon MNA është kryesisht e kufizuar në CAF, e cila është qeliza tumorale në një masë më të vogël, por nivele të dallueshme të MNA vërehen në qelizat T të derivuara nga tumori. Mbishprehja e NNMT në CAF ovarian ka një efekt të njohur që nxit kancerin, pjesërisht për shkak të promovimit të metabolizmit të CAF, pushtimit të tumorit dhe metastazës (27). Edhe pse niveli i përgjithshëm i TIL është i moderuar, shprehja e NNMT në CAF është e lidhur ngushtë me nëntipin mezenkimal të Atlasit të Gjenomit të Kancerit (TCGA), i cili shoqërohet me prognozë të dobët (27, 46, 47). Së fundmi, shprehja e enzimës AOX1 përgjegjëse për degradimin e MNA është gjithashtu e kufizuar në popullatën CAF, gjë që tregon se qelizat T nuk kanë aftësinë për të metabolizuar MNA. Këto rezultate mbështesin idenë se megjithëse nevojitet punë e mëtejshme për të verifikuar këtë gjetje, nivelet e larta të MNA në qelizat T mund të tregojnë praninë e një mikroambienti CAF imunosupresiv.
Duke pasur parasysh nivelin e ulët të shprehjes së transportuesve të MNA-së dhe nivelet e pazbulueshme të proteinave kyçe të përfshira në metabolizmin e MNA-së, prania e MNA-së në qelizat T është e papritur. As NNMT dhe as AOX1 nuk mund të zbulohen nga analiza scRNA-seq dhe qPCR e synuar e dy grupeve të pavarura. Këto rezultate tregojnë se MNA nuk sintetizohet nga qelizat T, por absorbohet nga TME përreth. Eksperimentet in vitro tregojnë se qelizat T kanë tendencë të grumbullojnë MNA ekzogjene.
Studimet tona in vitro kanë treguar se MNA ekzogjene shkakton shprehjen e TNFα në qelizat T dhe rrit lidhjen e Sp1 me promotorin e TNFα. Edhe pse TNFα ka funksione si antitumorale ashtu edhe antitumorale, në kancerin ovarian, TNFα mund të nxisë rritjen e kancerit ovarian (31-33). Neutralizimi i TNFα në kulturën e qelizave tumorale ovariane ose eliminimi i sinjalit TNFα në modelet e minjve mund të përmirësojë prodhimin e citokinës inflamatore të ndërmjetësuar nga TNFα dhe të pengojë rritjen e tumorit (32, 35). Prandaj, në këtë rast, MNA e derivuar nga TME mund të veprojë si një metabolit pro-inflamator përmes një mekanizmi të varur nga TNFα përmes lakut autokrin, duke nxitur kështu shfaqjen dhe përhapjen e kancerit ovarian (31). Bazuar në këtë mundësi, bllokimi i TNFα po studiohet si një agjent terapeutik potencial për kancerin ovarian (37, 48, 49). Përveç kësaj, MNA dëmton citotoksicitetin e qelizave CAR-T ndaj qelizave tumorale ovariane, duke ofruar prova të mëtejshme për shtypjen imunitare të ndërmjetësuar nga MNA. Së bashku, këto rezultate sugjerojnë një model në të cilin tumoret dhe qelizat CAF sekretojnë MNA në TME jashtëqelizore. Përmes (i) stimulimit të rritjes së kancerit ovarian të shkaktuar nga TNF dhe (ii) frenimit të aktivitetit citotoksik të qelizave T të shkaktuar nga MNA, kjo mund të ketë një efekt të dyfishtë tumoral (Figura 5D).
Si përfundim, duke aplikuar një kombinim të pasurimit të shpejtë të qelizave, sekuencimit të qelizave të vetme dhe profilizimit metabolik, ky studim zbuloi ndryshimet e mëdha imunometabolomike midis tumoreve dhe qelizave të ascitit në pacientët me HGSC. Kjo analizë gjithëpërfshirëse tregoi se ka ndryshime në thithjen e glukozës dhe aktivitetin mitokondrial midis qelizave T, dhe identifikoi MNA si një metabolit rregullator imunitar autonom jo-qelizor. Këto të dhëna kanë një ndikim në mënyrën se si TME ndikon në metabolizmin e qelizave T në kanceret njerëzore. Megjithëse është raportuar konkurrenca e drejtpërdrejtë për lëndë ushqyese midis qelizave T dhe qelizave kancerogjene, metabolitët gjithashtu mund të veprojnë si rregullatorë indirektë për të nxitur përparimin e tumorit dhe ndoshta për të shtypur përgjigjet imunitare endogjene. Përshkrimi i mëtejshëm i rolit funksional të këtyre metabolitëve rregullatorë mund të hapë strategji alternative për përmirësimin e përgjigjes imunitare anti-tumor.
Mostrat e pacientëve dhe të dhënat klinike u morën përmes depozitës së indeve të tumorit të kancerit në BC, e çertifikuar nga Rrjeti Kanadez i Depozitimit të Indeve. Sipas protokollit të miratuar nga Komiteti i Etikës së Kërkimit të Kancerit në BC dhe Universiteti i Kolumbisë Britanike (H07-00463), të gjitha mostrat dhe të dhënat klinike të pacientëve morën pëlqimin e tyre me shkrim të informuar ose hoqën dorë zyrtarisht nga pëlqimi i tyre. Mostrat ruhen në BioBank të çertifikuar (BRC-00290). Karakteristikat e detajuara të pacientit tregohen në Tabelat S1 dhe S5. Për krioprezervim, përdoret një bisturi për të dekompozuar mekanikisht mostrën e tumorit të pacientit dhe më pas për ta shtyrë atë përmes një filtri 100 mikronësh për të marrë një pezullim të vetëm qelizor. Asciti i pacientit u centrifugua në 1500 rpm për 10 minuta në 4°C për të peletuar qelizat dhe për të hequr supernatantin. Qelizat e marra nga tumori dhe asciti u kriokonservuan në 50% serum AB njerëzor të inaktivizuar me nxehtësi (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) dhe 10% dimetil sulfoksid. Këto pezullime të ruajtura të qelizave të vetme u shkrinë dhe u përdorën për metabolomikën dhe përcaktimin e metabolitëve të përshkruar më poshtë.
Mediumi i plotë përbëhet nga 0.22 μm të filtruar 50:50 të plotësuar me RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutaminë (Thermo Fisher Scientific) e plotësuar me 10% serum AB njerëzor të inaktivuar me nxehtësi (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutaminë (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x tretësirë ​​Penicilinë Streptomicine (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) dhe 50 μMB-merkaptoetanol. AimV (Invitrogen) është plotësuar me 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) dhe 2 mM l-glutaminë (Thermo Fisher Scientific). Tamponi ngjyrues i citometrit të rrjedhës përbëhej nga tretësirë ​​fiziologjike e tamponuar me fosfat të filtruar 0.22 μm (PBS; Invitrogen) e plotësuar me 3% serum njerëzor AB të inaktivuar me nxehtësi (Sigma). Tamponi i pasurimit të qelizave përbëhet nga PBS i filtruar 0.22μm dhe i plotësuar me 0.5% serum AB njerëzor të inaktivuar me nxehtësi (Sigma-Aldrich).
Në një mjedis të plotë në temperaturë 37°C, qelizat u ngjyrosën me 10 nM MT DR dhe 100 μM 2-NBDG për 30 minuta. Më pas, qelizat u ngjyrosën me ngjyruesin e qëndrueshmërisë eF506 në 4°C për 15 minuta. Risuspensiononi qelizat në FC Block (eBioscience) dhe Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), hollojini në tamponin e ngjyrosjes së citometrit me rrjedhë (sipas udhëzimeve të prodhuesit) dhe inkubojini për 10 minuta në temperaturë ambienti. Ngjyrosni qelizat me një grup antitrupash (Tabela S2) në tamponin e ngjyrosjes së citometrisë me rrjedhë në 4°C për 20 minuta. Risuspensiononi qelizat në tamponin e ngjyrosjes së citometrisë me rrjedhë (konfigurimi Cytek Aurora; konfigurimi 3L-16V-14B-8R) para analizës. Përdorni SpectroFlo dhe FlowJo V10 për të analizuar të dhënat e numërimit të qelizave dhe përdorni GraphPad Prism 8 për të krijuar të dhënat. Intensiteti mesatar i fluoreshencës (MFI) i 2-NBDG dhe MT DR u normalizua në mënyrë logaritmike dhe më pas u përdor një test t i çiftëzuar për analizën statistikore për të marrë në konsideratë pacientët e përputhur. Hiqni të gjitha popullatat me më pak se 40 ngjarje nga analiza; futni një vlerë MFI prej 1 për çdo vlerë negative përpara se të kryeni analizën statistikore dhe vizualizimin e të dhënave.
Për të plotësuar strategjinë manuale të hapjes së portës së panelit të procesit të mësipërm, ne përdorëm shënimin e plotë nga pema e kufizimit të formës (FAUST) (21) për të caktuar automatikisht qelizat në popullatë pas eliminimit të qelizave të vdekura në FlowJo. Ne e menaxhojmë manualisht rezultatin për të bashkuar popullatat që duket se janë të keqshpërndara (duke kombinuar qelizat PD1+ me qelizat tumorale PD1) dhe popullatat e mbajtura. Çdo mostër përmban një mesatare prej më shumë se 2% qelizash, për një total prej 11 popullatash.
Centrifugimi me dendësi gradient Ficoll u përdor për të ndarë PBMC-në nga produktet e ndarjes së leukociteve (STEMCELL Technologies). Qelizat T CD8 + u izoluan nga PBMC-ja duke përdorur CD8 MicroBeads (Miltenyi) dhe u zgjeruan në mjedis të plotë duke përdorur TransAct (Miltenyi) për 2 javë sipas udhëzimeve të prodhuesit. Qelizat u lanë të qëndronin për 5 ditë në mjedis të plotë që përmbante IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), dhe më pas u ristimuluan me TransAct. Në ditën 7, sipas udhëzimeve të prodhuesit, CD45 MicroBeads njerëzore (Miltenyi) u përdorën për të pasuruar qelizat në tre raunde radhazi. Qelizat u alikuotuan për analizën e citometrisë së rrjedhës (siç përshkruhet më sipër), dhe një milion qeliza u alikuotuan tre herë për analizën LC-MS/MS. Mostrat u përpunuan me LC-MS/MS siç përshkruhet më poshtë. Ne vlerësuam vlerën e metabolitit që mungonte me një numër jonik prej 1,000. Çdo mostër normalizohet nga numri total i jonit (TIC), konvertohet logaritmikisht dhe normalizohet automatikisht në MetaboAnalystR para analizës.
Suspensioni i qelizave të vetme të secilit pacient u shkri dhe u filtrua përmes një filtri 40 μm në një mjedis të plotë (siç përshkruhet më sipër). Sipas protokollit të prodhuesit, u përdorën tre raunde të njëpasnjëshme të përzgjedhjes pozitive me anë të ndarjes së sferave magnetike duke përdorur MicroBeads (Miltenyi) për të pasuruar mostrat për qelizat CD8+, CD4+ dhe CD45- (në akull). Shkurt, qelizat risuspendohen në tamponin e pasurimit të qelizave (siç përshkruhet më sipër) dhe numërohen. Qelizat u inkubuan me sfera njerëzore CD8, sfera njerëzore CD4 ose sfera njerëzore CD45 (Miltenyi) në 4°C për 15 minuta, dhe më pas u lanë me tamponin e pasurimit të qelizave. Mostra kalohet përmes kolonës LS (Miltenyi), dhe mblidhen fraksionet pozitive dhe negative. Për të zvogëluar kohëzgjatjen dhe për të maksimizuar hapin e rikuperimit të qelizave, fraksioni CD8 përdoret më pas për raundin e dytë të pasurimit CD4+, dhe fraksioni CD4 përdoret për pasurimin pasues të CD45. Mbajeni tretësirën në akull gjatë gjithë procesit të ndarjes.
Për të përgatitur mostrat për analizën e metabolitëve, qelizat u lanë një herë me tretësirë ​​kripe të ftohtë me akull dhe secilës mostër iu shtua 1 ml metanol 80%, pastaj u përzien në vorteks dhe u ngrinë menjëherë në azot të lëngshëm. Mostrat iu nënshtruan tre cikleve të ngrirjes-shkrirjes dhe u centrifuguan në 14,000 rpm për 15 minuta në 4°C. Supernatanti që përmbante metabolitët avullohet derisa të thahet. Metabolitët u ritretën në 50 μl acid formik 0.03%, u përzien në vorteks dhe më pas u centrifuguan për të hequr mbeturinat.
Ekstraktoni metabolitët siç përshkruhet më sipër. Transferoni supernatantin në një shishe kromatografie të lëngshme me performancë të lartë për kërkime metabolomike. Përdorni një protokoll trajtimi të rastësishëm për të trajtuar secilën mostër me një numër të ngjashëm qelizash për të parandaluar efektet e serisë. Ne kryem një vlerësim cilësor të metabolitëve globalë të botuar më parë në Spektrometrin e Masës Triple Quadrupole AB SCIEX QTRAP 5500 (50). Analiza kromatografike dhe integrimi i zonës së majës u kryen duke përdorur softuerin MultiQuant versioni 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Një numërim jonik prej 1000 u përdor për të vlerësuar vlerën e metabolitit që mungonte, dhe TIC i secilës mostër u përdor për të llogaritur zonën e kulmit të normalizuar të secilit metabolit të zbuluar për të korrigjuar ndryshimet e futura nga analiza instrumentale nga përpunimi i mostrës. Pasi TIC të normalizohet, MetaboAnalystR(51) (parametri parazgjedhur) përdoret për konvertimin logaritmik dhe shkallëzimin automatik të vijës së normës. Ne përdorëm PCA me paketën vegan R për të kryer analizë eksploruese të ndryshimeve të metabolomit midis llojeve të mostrave, dhe përdorëm analizën e redundancës së pjesshme për të analizuar pacientët. Përdorëm metodën Ward për të ndërtuar një dendrogram të hartës së nxehtësisë për të grupuar distancën Euklidiane midis mostrave. Ne përdorëm limma (52) mbi bollëkun e standardizuar të metabolitëve për të identifikuar metabolitët me bollëk të ndryshëm në të gjithë llojin e qelizës dhe mikroambientin. Për të thjeshtuar shpjegimin, ne përdorim parametrin mesatar të grupit për të specifikuar modelin dhe marrim në konsideratë llojet e qelizave në mikroambient si secili grup (n = 6 grupe); Për testin e rëndësisë, ne kryem tre matje të përsëritura për secilin metabolit. Për të shmangur replikimin e rremë, pacienti u përfshi si pengesë në modelin e limës. Për të kontrolluar ndryshimet në metabolitët midis pacientëve të ndryshëm, ne e rregulluam modelin e limës duke përfshirë pacientët në një mënyrë fikse. Ne raportojmë rëndësinë e kontrastit të paracaktuar midis llojit të qelizës dhe mikroambientit të Padj <0.05 (korrigjimi Benjamini-Hochberg).
Pas pasurimit të fuqishëm duke përdorur Kitin e Heqjes së Qelizave të Vdekura Miltenyi (>80% qëndrueshmëri), sekuencimi i transkriptomës së një qelize të vetme u krye në totalin e asciteve të ngrira të gjalla dhe mostrave të tumorit duke përdorur një protokoll shprehjeje të gjenit 10x 5′. U analizuan pesë raste me tumore dhe ascite që përputheshin, megjithëse qëndrueshmëria e ulët nga një mostër tumori pengoi përfshirjen e saj. Për të arritur përzgjedhje të shumëfishta të pacientëve, ne kombinuam mostrat e secilit pacient në korsitë e kontrolluesit 10x të kromit dhe analizuam ascitet dhe vendet e tumorit veçmas. Pas sekuencimit [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp fund i çiftëzuar (PE), gjenoma e Kebekut; Një mesatare prej 73,488 dhe 41,378 leximesh për qelizë për tumorin dhe ascitin përkatësisht]], ne përdorëm CellSNP dhe Vireo (53) (bazuar në CellSNP si SNP-së së zakonshme njerëzore (VCF) të ofruar nga GRCh38 i është caktuar një identitet donatori. Ne përdorim SNPRelate për të nxjerrë identitetin më të afërt (IBS) të statusit të gjenotipit të pacientit (IBS), duke përjashtuar qelizat e pacaktuara dhe qelizat e identifikuara si duplekse dhe donatorët që përputhen midis ascitit dhe mostrave të tumorit (54). Në bazë të kësaj detyre, ne mbajtëm tre raste me përfaqësim të bollshëm qelizor në tumor dhe ascit për analizën pasuese. Pas kryerjes së një hapi filtrimi masiv në paketimin BioConductor të shpërndarësit (55) dhe skranit (56), kjo dha 6975 qeliza (2792 dhe 4183 qeliza nga tumori dhe asciti, përkatësisht) për analizë. Ne përdorim grupimin Louvain të rrjetit të fqinjëve më të afërt (SNN) të ndarë të igraph (57) bazuar në distancën Jaccard në qelizat e grumbulluara sipas shprehjes. Grumbujve iu shënuan manualisht llojet e qelizave të supozuara bazuar në shprehjen e gjenit shënues dhe u vizualizuan me t-SNE. Qelizat T citotoksike përcaktohen nga shprehja e CD8A dhe GZMA, duke përjashtuar nëngrupet me shprehje të ulët të proteinave ribozomale. Ne iu qasëm të dhënave të publikuara të Izar et al. (16), duke përfshirë edhe ngulitjen e tyre të t-SNE, që mund të kontrollojë mbivendosjen e shprehjes midis shënuesve të qelizave imune dhe shprehjes së NNMT.
PBMC-të u ndanë nga produktet e ndarjes së leukociteve (STEMCELL Technologies) me anë të centrifugimit me dendësi gradient Ficoll. Qelizat CD3+ u izoluan nga PBMC-të duke përdorur sfera CD3 (Miltenyi). Në prani ose mungesë të MNA-së, qelizat CD3+ u aktivizuan me CD3 të lidhur me pllakë (5μg/ml), CD28 të tretshëm (3μg/ml) dhe IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Në ditën e fundit të zgjerimit, qëndrueshmëria (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) dhe përhapja (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) u vlerësuan me anë të citometrisë me rrjedhje. Vlerësoni funksionin e efektorit duke stimuluar qelizat me PMA (20 ng/ml) dhe jonomicinë (1μg/ml) me GolgiStop për 4 orë, dhe monitoroni CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) dhe TNFα-fluorescein izothiocianat (FITC) (MAb11, BD). Stimuloni qelizat qPCR dhe ChIP me PMA (20 ng/ml) dhe jonomicinë (1μg/ml) për 4 orë. Supernatanti ELISA u mblodh para dhe pas stimulimit me PMA (20 ng/ml) dhe jonomicinë (1 μg/ml) për 4 orë.
Ndiqni protokollin e prodhuesit për të izoluar ARN-në duke përdorur RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Përdorni QIAshredder (QIAGEN) për të homogjenizuar mostrën. Përdorni kitin ARN me kapacitet të lartë për ADNc (Thermo Fisher Scientific) për të sintetizuar ADN-në plotësuese (ADNc). Përdorni TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) për të përcaktuar sasinë e shprehjes së gjenit (sipas protokollit të prodhuesit) me sondat e mëposhtme: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [gliceraldehid-3-fosfat jashtë Hidrogjenit (GAPDH)] dhe Hs01010726_m1 (SLC22A2). Mostrat u analizuan në sistemin PCR në kohë reale StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) në pllakën e reagimit optik të shpejtë MicroAmp me 96 puseta (Applied Biosystems) me film optik MicroAmp. Çdo vlerë Ct që tejkalon 35 konsiderohet mbi pragun e zbulimit dhe shënohet si e pazbulueshme.
Kryeni ChIP siç është përshkruar më parë (58). Shkurt, qelizat u trajtuan me formaldehid (përqendrimi përfundimtar 1.42%) dhe u inkubuan në temperaturë ambienti për 10 minuta. Përdorni tampon ënjtjeje të plotësuar (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl dhe 0.1% NP-40) në akull për 10 minuta, pastaj risuspendojeni në tampon imunoprecipitimi siç është përshkruar (58). Mostra u skanua më pas me ciklet e mëposhtme: 10 cikle (20 pulse 1-sekondëshe) dhe një kohë statike prej 40 sekondash. Inkuboni antitrupat e imunoglobulinës G të gradës ChIP (Teknologjia e Signalizimit Qelizor; 1μl), histonit H3 (Teknologjia e Signalizimit Qelizor; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) dhe SP1 (Teknologjia e Signalizimit Qelizor; 3μl) me mostrën në 4°CC, tundeni gjatë natës. Inkuboni sferat e proteinës A (Thermo Fisher Scientific) me mostrën në 4°C me tundje të lehtë për 1 orë, më pas përdorni sferat chelex (Bio-Rad) për të pasuruar ADN-në dhe përdorni proteinazën K (Thermo Fisher) për tretjen e proteinave. Promotori i TNFα u zbulua me anë të PCR: përpara, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; përkundrazi, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (produkt 207-bp). Imazhet u prodhuan nga Image Lab (Bio-Rad) dhe u kuantifikuan duke përdorur softuerin ImageJ.
Supernatanti i kulturës qelizore u mblodh siç përshkruhet më sipër. Përcaktimi u krye sipas procedurave të prodhuesit të kitit ELISA të TNFα njerëzore (Invitrogen), kitit ELISA të IL-2 njerëzore (Invitrogen) dhe kitit ELISA të IFN-γ njerëzore (Abcam). Sipas protokollit të prodhuesit, supernatanti u hollua 1:100 për të zbuluar TNFα dhe IL-2, dhe 1:3 për të zbuluar IFN-γ. Përdorni EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) për të matur thithjen në 450 nm.
PBMC-të u ndanë nga produktet e ndarjes së leukociteve (STEMCELL Technologies) me anë të centrifugimit me dendësi gradient Ficoll. Qelizat CD3+ u izoluan nga PBMC-të duke përdorur sfera CD3 (Miltenyi). Në prani ose mungesë të MNA-së, qelizat CD3+ u aktivizuan me CD3 të lidhur me pllakë (5μg/ml), CD28 të tretshëm (3μg/ml) dhe IL-2 (300 U/ml; Proleukin) për 3 ditë. Pas 3 ditësh, qelizat u mblodhën dhe u lanë me tretësirë ​​fiziologjike 0.9%, dhe peleti u ngri menjëherë. Numërimi i qelizave u krye me anë të citometrisë me rrjedhje (Cytek Aurora; konfigurimi 3L-16V-14B-8R) duke përdorur 123count eBeads.
Ekstrakti i metabolitëve siç përshkruhet më sipër. Ekstrakti i tharë u rikonstituua në një përqendrim prej 4000 ekuivalentësh qelizash/μl. Analizoni mostrën me anë të kromatografisë me fazë të kundërt (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) dhe kolonës CORTECS T3 (2.1×150 mm, madhësia e grimcave 1.6-μm, madhësia e poreve 120-Å; #186008500, Waters). Spektrometër mase polar (6470, Agilent), në të cilin jonizimi me elektrospërkatje funksionon në modalitetin pozitiv. Faza mobile A është 0.1% acid formik (në H2O), faza mobile B është 90% acetonitril, 0.1% acid formik. Gradienti LC është 0 deri në 2 minuta për 100% A, 2 deri në 7.1 minuta për 99% B dhe 7.1 deri në 8 minuta për 99% B. Pastaj riekuilibroni kolonën me fazën mobile A me një shpejtësi rrjedhjeje prej 0.6 ml/min për 3 minuta. Shpejtësia e rrjedhjes është 0.4 ml/min dhe dhoma e kolonës nxehet në 50°C. Përdorni standardin kimik të pastër të MNA-së (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanada) për të përcaktuar kohën e mbajtjes (RT) dhe transformimin (RT = 0.882 minuta, transformimi 1 = 137→94.1, transformimi 2 = 137→92, Konvertimi 3 = 137→78). Kur të tre tranzicionet ndodhin në kohën e saktë të mbajtjes, tranzicioni 1 përdoret për përcaktim sasior për të siguruar specifikën. Kurba standarde e MNA-së (Toronto Research Chemical Company) u gjenerua nga gjashtë hollime serike të tretësirës bazë (1 mg/ml) për të marrë standarde prej 0.1, 1.0, 10 dhe 100 ng/ml dhe 1.0 dhe 10μg/ml përkatësisht të lëngshme. Limiti i zbulimit është 1 ng/ml, dhe përgjigja lineare është midis 10 ng/ml dhe 10μg/ml. Çdo injeksion prej dy mikrolitrash të mostrës dhe standardit përdoret për analizën LC/MS, dhe një mostër e përzier e kontrollit të cilësisë përdoret çdo tetë injeksione për të siguruar stabilitetin e platformës së analizës. Përgjigjet MNA të të gjitha mostrave qelizore të trajtuara me MNA ishin brenda diapazonit linear të analizës. Analiza e të dhënave u krye duke përdorur programin e analizës sasiore MassHunter (v9.0, Agilent).
Konstrukti i gjeneratës së dytë αFR-CAR u mor nga Song et al. (59). Shkurt, konstrukti përmban përmbajtjen e mëposhtme: sekuencën udhëheqëse CD8a, fragmentin variabël me zinxhir të vetëm specifik për αFR-në njerëzore, rajonin e menteshës dhe transmembranës CD8a, domenin intraqelizor CD27 dhe domenin intraqelizor CD3z. Sekuenca e plotë CAR u sintetizua nga GenScript dhe më pas u klonua në vektorin e shprehjes lentiviral të gjeneratës së dytë në rrjedhën e sipërme të kasetës së shprehjes GFP të përdorur për të vlerësuar efikasitetin e transduksionit.
Lentivirusi prodhohet me anë të transfektimit të qelizave HEK293T [Koleksioni Amerikan i Kulturave të Tipit (ATCC); i rritur në mjedisin e modifikuar Dulbecco's Eagle që përmban 10% serum fetal të gjedhit (FBS) dhe 1% PenStrep, dhe është përdorur vektori CAR-GFP dhe plazmidet e paketimit (psPAX2 dhe pMD2.G, Addgene) përdorin aminë lipofektimi (Sigma-Aldrich). Supernatanti që përmbante virusin u mblodh 48 dhe 72 orë pas transfektimit, u filtrua dhe u përqendrua me ultracentrifugim. Ruajeni supernatantin viral të përqendruar në -80°C deri në transduksion.
PBMC-të ndahen nga produktet e ndarjes së leukociteve të donatorëve të shëndetshëm (STEMCELL Technologies) me anë të centrifugimit me dendësi gradient Ficoll. Përdorni mikrosfera CD8 me përzgjedhje pozitive (Miltenyi) për të izoluar qelizat CD8+ nga PBMC-të. Stimuloni qelizat T me TransAct (Miltenyi) dhe në mjedisin TexMACS [Miltenyi; i plotësuar me 3% serum njerëzor të inaktivizuar nga nxehtësia, 1% PenStrep dhe IL-2 (300 U/ml)]. Njëzet e katër orë pas stimulimit, qelizat T u transdukuan me lentivirus (10 μl supernatant i përqendruar i virusit për 106 qeliza). 1 deri në 3 ditë pas transduksionit në Cytek Aurora (në FSC (Shpërndarje përpara)/SSC (Shpërndarje anësore), Singlet, GFP+), vlerësoni shprehjen e GFP të qelizave për të demonstruar një efikasitet transduksioni prej të paktën 30%.
Qelizat CAR-T u kultivuan për 24 orë në Immunocult (STEMCELL Technologies; të plotësuara me 1% PenStrep) në kushtet e mëposhtme: të patrajtuara, të trajtuara me 250 μM adenozinë ose 10 mM MNA. Pas trajtimit paraprak, qelizat CAR-T u lanë me PBS dhe u kombinuan me 20,000 qeliza SK-OV-3 [ATCC; në mjedisin McCoy 5A (Sigma-Aldrich) të plotësuar me 10% FBS dhe 1% PenStrep në 10: Raporti efektor ndaj objektivit prej 1 u amplifikua në trefish në mjedisin e plotësuar Immunocult. Qelizat SK-OV-3 dhe qelizat SK-OV-3 të lizuara me saponinë digitalis (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) u përdorën si kontrolle negative dhe pozitive, përkatësisht. Pas 24 orësh bashkëkultivimi, supernatanti u mblodh dhe laktat dehidrogjenaza (LDH) u mat sipas udhëzimeve të prodhuesit (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Supernatanti LDH u hollua 1:50 në tampon LDH. Përqindja e vrasjes u mat duke përdorur formulën e mëposhtme: përqindja e vrasjes = përqindja e korrigjimit / shkalla maksimale e vrasjes x 100%, ku përqindja e korrigjimit = bashkëkulturë - vetëm qelizat T, dhe shkalla maksimale e vrasjes = kontroll pozitiv - kontroll negativ.
Siç përshkruhet në tekst ose në materiale dhe metoda, përdorni GraphPad Prism 8, Microsoft Excel ose R v3.6.0 për analizë statistikore. Nëse mblidhen mostra të shumta nga i njëjti pacient (siç është asciti dhe tumori), ne përdorim një test t të çiftëzuar ose e përfshijmë pacientin si një efekt të rastësishëm në një model linear ose të përgjithësuar sipas rastit. Për analizën metabolomike, testi i rëndësisë kryhet në trefish.
Për materiale shtesë për këtë artikull, ju lutemi shihni http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Ky është një artikull me akses të hapur i shpërndarë sipas kushteve të Licencës Creative Commons Attribution-Jo-Commercial, e cila lejon përdorimin, shpërndarjen dhe riprodhimin në çdo medium, për sa kohë që përdorimi përfundimtar nuk është për përfitim komercial dhe kushti kryesor është që vepra origjinale të jetë e saktë. Referencë.
Shënim: Ne ju kërkojmë vetëm të jepni adresën tuaj të email-it në mënyrë që personi që ju rekomandoni në faqe të dijë se ju dëshironi që ai ta shohë email-in dhe se nuk është spam. Ne nuk do të kapim asnjë adresë email-i.
Kjo pyetje përdoret për të testuar nëse jeni vizitor dhe për të parandaluar dërgimin automatik të spam-it.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson (Brad H. Nelson R. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA kontribuon në shtypjen imunitare të qelizave T dhe përfaqëson një objektiv të mundshëm imunoterapie për trajtimin e kancerit tek njerëzit.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson (Brad H. Nelson R. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA kontribuon në shtypjen imunitare të qelizave T dhe përfaqëson një objektiv të mundshëm imunoterapie për trajtimin e kancerit tek njerëzit.
©2021 Shoqata Amerikane për Avancimin e Shkencës. të gjitha të drejtat e rezervuara. AAAS është partner i HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dhe COUNTER. Shkenca përparon ISSN 2375-2548.