Faleminderit që vizituat Nature.com. Versioni i shfletuesit që po përdorni ka mbështetje të kufizuar për CSS. Për përvojën më të mirë, ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose të çaktivizoni modalitetin e përputhshmërisë në Internet Explorer). Ndërkohë, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne do ta shfaqim faqen pa stile dhe JavaScript.
Ndryshe nga vertebrorët, insektet mendohet gjerësisht se nuk kanë hormone steroide seksuale të paragjykuara nga meshkujt. Tek Anopheles gambiae, steroidi ekdizon 20-hidroksiekdizon (20E) duket se ka evoluar për të kontrolluar zhvillimin e vezëve kur sintetizohet nga femrat2 dhe për të shkaktuar një periudhë refraktare çiftëzimi kur transferohet seksualisht nga meshkujt3. Meqenëse zhvillimi i vezëve dhe çiftëzimi janë tipare thelbësore riprodhuese, të kuptuarit se si mushkonjat femra Anopheles integrojnë këto sinjale hormonale mund të lehtësojë hartimin e programeve të reja të kontrollit të malaries. Këtu, ne zbulojmë se këto funksione riprodhuese rregullohen nga steroide të dallueshme seksuale përmes një rrjeti kompleks enzimash aktivizuese/inaktivizuese të ekdisteroideve. Ne identifikuam një ekdizon të oksiduar specifik për meshkujt, 3-dehidro-20E (3D20E), që mbron prejardhjen duke mbyllur pranueshmërinë seksuale të femrës pas transferimit seksual dhe aktivizimit nga defosforilimi. Veçanërisht, transferimi 3D20E gjithashtu shkaktoi shprehjen e gjeneve riprodhuese që ruajnë zhvillimin e vezëve gjatë infeksionit Plasmodium, duke siguruar shëndetin e femrave të infektuara. 20E i derivuar nga femrat nuk shkakton një marrëdhënie seksuale. përgjigje, por u lejon individëve në çiftëzim të lëshojnë vezë pasi kinazat që frenojnë 20E të jenë frenuar. Identifikimi i këtij hormoni steroid specifik për insektet mashkullore dhe roli i tij në rregullimin e ndjeshmërisë seksuale femërore, pjellorisë dhe ndërveprimit me Plasmodium sugjeron potencialin për të zvogëluar suksesin riprodhues të mushkonjave që transmetojnë malarien.
Rastet dhe vdekjet nga malaria janë përsëri në rritje4 për shkak të rezistencës së përhapur ndaj insekticideve te mushkonjat Anopheles, vektori i vetëm i parazitëve të malaries tek njerëzit. Biologjia e çiftëzimit të këtyre mushkonjave është një objektiv veçanërisht tërheqës për ndërhyrje të reja të kontrollit të malaries, sepse femrat çiftëzohen vetëm një herë5; duke e bërë këtë ngjarje të vetme çiftëzimi sterile do të kishte potencial të madh për të zvogëluar popullatat e mushkonjave në fushë.
Gratë bëhen të paafta seksualisht pasi marrin hormone steroide me titër të lartë nga burrat. Studimet kanë treguar se shkaku i vështirësisë në çiftëzimin e mëtejshëm është 20-hidroksiekdizona (20E), një hormon steroid i njohur më mirë si rregullator i ciklit të ndërrimit të vezëve në fazën larvore. Aftësia e meshkujve për të sintetizuar dhe transferuar 20E ka evoluar posaçërisht në speciet Anopheles që janë pjesë e nëngjinisë Cellia7, e cila është e shpërndarë në Afrikë dhe përfshin vektorët më të rrezikshëm të malaries, duke përfshirë Anopheles gambiae. Kjo është veçanërisht e rëndësishme sepse në këto specie femrat gjithashtu prodhojnë 20E pas çdo vakti gjaku, dhe 20E drejton ciklin e oogjenezës (shih ref. 8). Megjithatë, pak dihet për mënyrën se si femrat integrojnë sinjale nga dy burime të ndryshme të ekdizonës (transferimi i meshkujve dhe induksioni i ushqyerjes me gjak) pa kompromentuar aftësinë e tyre për t'u çiftëzuar. Në fakt, nëse 20E e prodhuar nga femrat shkakton intolerancë seksuale, kjo do të çojë në infertilitet tek individët që ushqehen me virgjëresha, një sjellje shumë e zakonshme tek këto mushkonja5.
Një shpjegim i mundshëm është se meshkujt e A. gambiae transferojnë një ekdizon të modifikuar specifik për meshkujt, i cili aktivizon një kaskadë sinjalizimi në traktin riprodhues femëror, duke rezultuar në paqëndrueshmëri të çiftëzimit. Megjithatë, megjithëse vertebrorët kanë hormone të shumta steroide, të tilla si estrogjeni dhe androgjeni (të shqyrtuara në ref. 9), për sa dimë ne, steroidet e anuara nga androgjeni nuk janë identifikuar tek insektet.
Ne nisëm të përcaktonim repertorin e hormoneve steroide në gjëndrën ndihmëse mashkullore (MAG) të A. gambiae të pjekur seksualisht në kërkim të steroideve të mundshme modifikuese. Duke përdorur kromatografi të lëngshme me performancë të lartë të shoqëruar me spektrometri masive tandem (HPLC-MS/MS) në vend të metodës më pak specifike të përdorur më parë, ne zbuluam ekdizon (E) dhe 20E në këtë ind, duke konfirmuar rezultatin e mëparshëm. Megjithatë, mostra u dominua nga steroidet e fosforiluara të oksiduara, në përputhje me formulën 3-dehidro-20E-22-fosfat (3D20E22P)12 (Figura 1). Forma të tjera përfshijnë 3-dehidro-20E (3D20E) dhe 20E-22-fosfat (20E22P). Intensiteti i sinjalit HPLC-MS/MS i 3D20E22P ishte dy rend madhësie më i lartë se forma e tij e defosforiluar, 3D20E, dhe tre rend madhësie më i lartë se ai i E dhe 20E (Figura 1). Megjithëse në pjesë të tjera të trupit dhe në pjesën e poshtme trakti riprodhues (LRT; Të dhëna të zgjeruara Fig. 1a). Ne gjithashtu analizuam ekdisteroidet te meshkujt dhe femrat e sapo mbyllura (<1 ditëshe) dhe zbuluam 3D20E dhe 3D20E22P vetëm në MAG; E, 20E dhe 20E22P ishin të pranishme në të dy gjinitë (Të dhëna të zgjeruara Fig. 1b). Këto të dhëna sugjerojnë që meshkujt e rritur të A. gambiae prodhojnë titre të larta të hormoneve modifikuese në MAG-të e tyre që nuk sintetizohen nga femrat.
MAG dhe LRT femërore (duke përfshirë atria, fshikëzat seminale dhe parovariumin) u disektuan nga meshkuj të virgjër 4-ditorë (4-ditorë) dhe femra të virgjëra dhe të çiftëzuara (0.5, 3 dhe 12 hpm). Ekdisoni në këto inde u analizua me HPLC-MS/MS (mesatarja ± sem; testi t i paçiftuar, dyanësh, shkalla e zbulimit të rremë (FDR) e korrigjuar; NS, jo e rëndësishme; *P < 0.05, **P < 0.01. 3D20E: 3 orë kundrejt 0.5 orëve, P = 0.035; 12 orë kundrejt 3 orëve, P = 0.0015; 12 orë kundrejt 0.5 orëve, P = 0.030. 3D20E22P: 3 orë kundrejt 0.5 orëve, P = 0.25; 12 orë kundrejt 3 orëve, P = 0.0032; 12 orë kundrejt 0.5 orësh, P = 0.015). Të dhënat janë nga tre replikime biologjike. Sipërfaqja e pikut për secilin ekdizon me interes u llogarit dhe u normalizua nga numri i mushkonjave. Ekdizona përfaqësohet nga ngjyra si më poshtë: E, jeshile; 20E, portokalli; 20E22P, vjollcë; 3D20E, blu; 3D20E22P, rozë. Futja rrit shkallën në boshtin y për të treguar nivele më të ulëta të ekdizonës.
Për të hetuar nëse 3D20E22P dhe 3D20E transferohen gjatë çiftëzimit, ne disektuam LRT-të femra në pika të ndryshme kohore pas çiftëzimit. Megjithëse ekdisoni nuk u gjet tek virgjëreshat, ne vumë re sasi të konsiderueshme të 3D20E22P në LRT menjëherë pas çiftëzimit (0.5 orë pas çiftëzimit, hpm), duke u zvogëluar me kalimin e kohës, ndërsa nivelet e 3D20E u rritën ndjeshëm (Fig. 1). Duke përdorur 3D20E të sintetizuar kimikisht si standard, ne përcaktuam se nivelet e këtij hormoni steroid në LRT-të e çiftëzimit ishin të paktën 100 herë më të larta se 20E (Tabela 1 e të Dhënave të Zgjeruara). Kështu, 3D20E22P është ekdisoni kryesor mashkullor që transferohet tek LRT femërore gjatë çiftëzimit, dhe forma e tij e defosforiluar, 3D20E, bëhet shumë e bollshme menjëherë pas çiftëzimit. Kjo sugjeron një rol të rëndësishëm për ekdisonin e fundit në biologjinë e femrave pas çiftëzimit.
Pas gjenerimit të një seti të dhënash të re për sekuencimin e ARN-së (RNA-seq) (Fig. 2a), duke përdorur një tubacion bioinformatik të ndërtuar me porosi, ne kërkuam për ekdizon kinazën (EcK), ekdizon oksidazën (EO) dhe ekdizonin që kodon gjenin e fosfatazës të modifikuar me 20E. EPP) shprehet në indet riprodhuese. Ne identifikuam një gjen kandidat EPP dhe dy gjene potenciale EcK (EcK1 dhe EcK2), por nuk ishim në gjendje të gjenim një gjen të mirë kandidat EO. Veçanërisht, gjenet individuale EPP u shprehën në nivele të larta (percentili 98.9) në MAG-të Gambiane, por jo në LRT-të femërore (Fig. 2b), në kundërshtim me pritjet tona, pasi defosforilimi i 3D20E22P ndodhi në këtë ind femëror. Prandaj, ne besojmë se EPP mashkullore mund të transferohet gjatë çiftëzimit. Në të vërtetë, ne përdorëm etiketimin e izotopit të qëndrueshëm in vivo për të maskuar proteinën femërore pas çiftëzimit, një enzimë e identifikuar nga MS në atriumin femëror (Fig. 2c dhe Tabela Plotësuese 1). Prania e EPP në MAG dhe LRT femërore të çiftëzuar (por jo të virgjër) u konfirmua gjithashtu duke përdorur antitrupa specifikë (Fig. 2d).
a, Një tubacion bioinformatik i ndërtuar me porosi për të kërkuar indet riprodhuese të secilës gjini për gjenet që kodojnë EcK, EO dhe EPP. Numrat pranë shigjetave tregojnë numrin e kandidatëve meshkuj dhe femra në secilin hap. Kjo analizë identifikoi një gjen EPP (EPP) dhe një gjen EcK (EcK1) që shprehen te meshkujt, dhe një gjen EcK (EcK2) që shprehet te të dy gjinitë, por nuk jep një gjen EO kandidat. b, Hartë nxehtësie që krahason shprehjen e gjenit kandidat në indet e virgjëra (V) dhe çiftëzuese (M) të Anopheles gambiae dhe Anopheles albicans. Spca, fekondimi; MAG, gjëndra ndihmëse te meshkujt; pjesë të tjera të trupit, duke përfshirë gjinjtë, krahët, këmbët, trupat e dhjamosur dhe organet e brendshme në të dy gjinitë, dhe vezoret në femra. EcK2 shprehet shumë si në MAG ashtu edhe në atriumet e Gambisë, ndërsa EPP gjendet vetëm në MAG. c, Analiza proteomike e zhvendosjes së grupit të ejakulatit mashkullor në atriumet femërore në 3, 12 dhe 24 hpm, duke treguar 67 proteinat më të bollshme. Femrat u rritën me një dietë që përmbante 15N për të etiketuar (dhe maskuar) të gjitha proteinat. Meshkujt e paetiketuar u çiftëzuan me femra të etiketuara, dhe LRT-të femra u disektuan në 3, 12 dhe 24 hpm për analizë proteomike (shih Tabelën Plotësuese 1 për një listë të plotë të proteinave ejakuluese). Nënshkrimi, EPP, Eck1 dhe EcK2 u zbuluan në MAG të meshkujve të virgjër me anë të analizës proteomike të këtyre indeve. d, EPP u zbulua me anë të western blot në MAG dhe LRT të femrave të çiftëzuara, por jo në femrat ose meshkujt e virgjër ose pjesën tjetër të femrës. trupi. Membranat u testuan njëkohësisht me antitrupa anti-aktinë (kontroll ngarkimi) dhe anti-EPP. Të gjithë meshkujt janë të virgjër. Shih Figurën Plotësuese 1 për të dhënat e burimit të xhelit. Western blot u kryen dy herë me rezultate të ngjashme.
Aktiviteti i fosfofosfatazës ekdisteroide të EPP u verifikua pas inkubimit me HPLC-MS/MS me 3D20E22P të izoluar nga MAG (Të dhëna të zgjeruara Fig. 2a). Për më tepër, kur heshtnim EPP me anë të ndërhyrjes së ndërmjetësuar nga ARN (RNAi), zbuluam një reduktim të fortë të aktivitetit të fosfatazës në indet riprodhuese të këtyre meshkujve (Fig. 3a), dhe femrat e çiftëzuara me meshkuj të heshtur nga EPP treguan një përqindje të konsiderueshme më të ulët të 3D20E të defosforiluar (Fig. 3b) pavarësisht heshtjes së pjesshme të gjenit (Të dhëna të zgjeruara Fig. 2b,c). Në të kundërt, nuk zbuluam ndryshime të rëndësishme në raportin 20E22P/20E në të njëjtat mushkonja, gjë që mund të sugjerojë që enzima është specifike për 3D20E22P (Fig. 3b).
a, Aktiviteti i zvogëluar i fosfatazës në MAG i shkaktuar nga heshtja e EPP duke përdorur kontrolle të ARN-së EPP me dy fije (dsEPP) ose ARN-së GFP me dy fije (dsGFP). Njëzet grupe MAG u përdorën në secilën replikim (P = 0.0046, testi t i çiftëzuar, dyanësor), të përfaqësuar nga pika të ndara. b, Femrat e çiftëzuara me meshkuj të heshtur nga EPP kishin një përqindje dukshëm më të ulët të 3D20E të defosforiluar në 3 hpm (P = 0.0043, testi t i paçiftuar, dyanësor), ndërsa nivelet e 20E nuk u prekën (P = 0.063, i paçiftuar). testi t, dypalësh). Të dhënat paraqiten si mesatare ± sem nga tre grupe prej 13, 16 dhe 19 femra secila.c, Femrat e çiftëzuara me meshkuj të heshtur nga EPP kishin shkallë dukshëm më të larta të riçiftëzimit (P = 0.0002, testi i saktë i Fisher-it, dypalësh). Femrat u detyruan së pari të çiftëzoheshin për të siguruar statusin e tyre të çiftëzimit; 2 ditë më vonë, ata u kontaktuan me meshkuj të tjerë që mbanin spermë transgjenike për të vlerësuar shkallët e ri-çiftëzimit me anë të zbulimit sasior PCR të transgjenit.d, Femrat e ushqyera me gjak të çiftëzuara me meshkuj të heshtur nga EPP kishin pjellori të reduktuar ndjeshëm (P < 0.0001; testi Mann-Whitney, dyanësor) dhe numër vezësh pak të reduktuar (P = 0.088, testi Mann-Whitney, dyanësor), ndërsa shkalla e pjelljes nuk u ndikua (P = 0.94, testi i saktë i Fisher-it, dyanësor). Në të gjitha panelet, n përfaqëson numrin e mostrave të mushkonjave biologjikisht të pavarura. NS, jo i rëndësishëm.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
Më pas, ne vlerësuam nëse defosforilimi i ekdizonit është i rëndësishëm për nxitjen e rezistencës ndaj çiftëzimit tek femrat. Veçanërisht, femrat e çiftëzuara me meshkuj të varfër me EPP u çiftëzuan përsëri në një frekuencë shumë më të lartë (44.9%) sesa femrat e kontrollit (10.4%) kur u ekspozuan ndaj meshkujve të tjerë (transgjenikë) (Fig. 3c). Ne gjithashtu vumë re një rënie të ndjeshme të pjellorisë (Fig. 3d, majtas) dhe një rënie të lehtë në numrin e vezëve të vendosura nga këto femra (Fig. 3d, në mes), ndërsa përqindja e vezëve të vendosura nga femrat (një përgjigje tjetër e nxitur tek femrat nga çiftëzimi)) nuk u prek (Fig. 3d, djathtas). Duke pasur parasysh specifikën e vëzhguar të EPP për 3D20E22P, këto rezultate sugjerojnë që aktivizimi i 3D20E nga EPP e transferuar gjatë çiftëzimit mund të ketë një rol të rëndësishëm në ndërprerjen e ndjeshmërisë së femrave ndaj çiftëzimit të mëtejshëm, një sjellje që më parë i atribuohej transferimit seksual të 20E. Prandaj, ky hormon specifik mashkullor ndikon gjithashtu fuqishëm në pjellorinë femërore.
Më pas, krahasuam aktivitetet e 20E dhe 3D20E në eksperimentet e injektimit në virgjëresha seksualisht të pjekura duke përdorur 3D20E të sintetizuar kimikisht (Fig. 4a-c) dhe 20E të disponueshme komercialisht. Vërejtëm se 3D20E ishte dukshëm më efektiv se 20E në ndërprerjen e ndjeshmërisë së femrave ndaj çiftëzimit në të dy përqendrimet (Fig. 4d). Veçanërisht, gjysma e nivelit fiziologjik të 3D20E në LRT (1,066 pg pas injektimit kundrejt 2,022 pg pas çiftëzimit) shkaktoi një përqindje të femrave rezistente që ishte 20 herë më e lartë se niveli fiziologjik i 20E (361 pg pas injektimit) 24 orë pas injektimit në përqendrimin më të lartë 18 pg pas çiftëzimit; Tabela e të Dhënave të Zgjeruara 1). Ky rezultat është në përputhje me idenë se transferimi seksual i 20E nuk shkakton periudha refraktare të çiftëzimit, dhe më tej tregon 3D20E si një faktor kryesor në sigurimin e marrëdhënies prind-fëmijë. 3D20E ishte gjithashtu dukshëm më aktiv se 20E në analizat e vendosjes së vezëve tek femrat e virgjëra (Fig. 4e), duke sugjeruar që shkalla normale e vendosjes së vezëve që vumë re pas heshtjes së pjesshme të EPP ishte për shkak të pranisë së aktivitetit të mbetur 3D20E të prodhuar ende nga faktorët femra të shkaktuar nga çiftëzimi.
(a,b) 3D20E e sintetizuar kimikisht nga 20E (a) me konvertim/efikasitet shumë të lartë (të dhënat e paraqitura si mesatare ± sem nga tre reaksione të pavarura të sintezës) (b).c, Spektri i masës (gjysma e poshtme) përputhet saktësisht me ekdizonin e gjetur në LRT femërore të çiftëzuar (gjysma e sipërme).d, Krahasuar me 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; testi i saktë i Fisher-it, dyanësor) dhe 10% etanol (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; testi i saktë i Fisher-it, dyanësor), ndërsa 20E ishte dukshëm më i lartë se kontrolli vetëm në doza më të larta (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; testi i saktë i Fisher-it, dyanësor).e, injeksioni i 3D20E i induktuar Shkalla dukshëm më të larta të pjelljes te femrat e virgjëra sesa te kontrollet me 10% etanol (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; testi i saktë i Fisher-it, dyanësor), ndërsa 20E krahasohet me kontrollet Vetëm në doza më të larta (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; testi i saktë i Fisher-it, dyanësor). 3D20E shkaktoi shkallë dukshëm më të larta të pjelljes sesa 20E në doza më të larta (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; testi i saktë i Fisher-it, dyanësor). Në të gjitha panelet, n përfaqëson numrin e mostrave të mushkonjave biologjikisht të pavarura. NS, jo i rëndësishëm. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. Të dhënat janë nga tre replikon.
Në studimet e mëparshme, ne përcaktuam se transferimi seksual i hormoneve steroide shkakton shprehjen e MISO (Mating-Induced Costume Stimulator of Oogenesis 11), një gjen riprodhues femëror që mbron femrat A. gambiae nga infeksioni P. falciparum. Kostot shëndetësore të shkaktuara nga 13, paraziti më vdekjeprurës i malaries njerëzore. Duke pasur parasysh rëndësinë e MISO për aftësinë riprodhuese të Anopheles në zonat endemike të malaries, ne vendosëm të përcaktojmë se cili hormon 3D20E ose 20E shkakton shprehjen e këtij gjeni. Ne zbuluam se ndërsa injektimi i 20E shkaktonte në mënyrë specifike ose më fuqishëm disa receptorë hormonalë bërthamorë (HR), siç janë HR3 dhe HR4, dhe objektiva tipike steroide në rrjedhën e poshtme, siç janë gjenet yolkogjene Vg14, 15, 16, MISO ishte më i fuqishëm i shkaktuar nga 3D20E (Të dhëna të zgjeruara Fig. 3). Kështu, transferimi seksual i këtij hormoni steroide androgjenik duket se shkakton mekanizma që mbrojnë femrat nga kostot e paraqitura nga infeksioni parazitar. Për më tepër, 3D20E ndikon në mënyrë të ndryshme në të dy izoformat. të receptorit E EcR, duke induktuar EcR-A dhe duke shtypur EcR-B, dhe duke shkaktuar më fuqishëm gjene të tjera që nxisin çiftëzimin, përfshirë HPX15, i cili ndikon në fertilitetin femëror. Kjo mund të shpjegojë infertilitetin e konsiderueshëm të vërejtur tek femrat e çiftëzuara me meshkuj të heshtur nga EPP (Të dhëna të zgjeruara Fig. 3). Këto të dhëna sugjerojnë ekzistencën e shtigjeve të rrjedhës së poshtme të aktivizuara në mënyrë preferenciale nga dy hormone ekdizonike që mund të jenë në themel të funksionit specifik të seksit.
Më pas, ne testuam funksionin e dy gjeneve EcK të identifikuara në tubacionin tonë bioinformatik. Heshtja e EcK1 ose EcK2 rezultoi në vdekshmëri të konsiderueshme tek meshkujt (Të dhëna të zgjeruara Fig. 4a), duke sugjeruar që fosforilimi i ekdizonës, dhe kështu inaktivizimi, është i rëndësishëm për mbijetesën. Meqenëse EcK2 u shpreh në nivele më të larta se EcK1 dhe u zbulua në MAG nga proteomika (Fig. 2b, c dhe Tabela Plotësuese 2), ne vërtetuam aktivitetin e saj të kinazës ekdisteroid duke e inkubuar atë me 20E, gjë që rezultoi në fosforilimin e 20E22P (Figura 2 e të dhënave të zgjeruara).4b). Kur përdorëm 3D20E si substrat, ne nuk ishim në gjendje të zbulonim produktin e fosforiluar 3D20E22P (Figura 4c e të dhënave të zgjeruara), duke sugjeruar që 20E në vend të 3D20E mund të jetë objektivi i preferuar i EcK2.
Sipas analizës sonë të ARN-seq, EcK2 u shpreh gjithashtu shumë në LRT të femrave të virgjëra, ku u fik pas çiftëzimit (Fig. 2b). Ne i konfirmuam këto të dhëna dhe përcaktuam se shprehja e EcK2 nuk u ndikua nga ushqyerja me gjak (Të dhëna të zgjeruara Fig. 5a). Duke zgjeruar eksperimentet tona fillestare MS, ne përcaktuam se kulmi i 20E22P ishte i lidhur ngushtë me kulmin e 20E (22-26 orë pas vaktit të gjakut; Të dhëna të zgjeruara Fig. 5b). Heshtja e EcK2 te femrat e virgjëra rezultoi në një rritje 3-fish të raportit relativ të 20E me 20E22P në 26 orë pas vaktit të gjakut (Figurat e të dhënave të zgjeruara 2c dhe 5c), duke konfirmuar se EcK2 gjithashtu fosforilon 20E te femrat. Veçanërisht, virgjëreshat e varfëra me EcK2 ruajtën pranueshmëri të plotë seksuale (Të dhëna të zgjeruara Fig. 5d, e), duke sugjeruar më tej se prodhimi i 20E nga femrat nuk shkakton periudha refraktare të çiftëzimit. Megjithatë, këto femra kishin nivele të konsiderueshme të lëshimit të vezëve krahasuar me grupet kontrolluese, me më shumë se 30% të virgjëreshave që lëshonin vezë (Të dhëna të zgjeruara Fig. 5f). Nëse injeksionet e ARN-së dyfishe Eck2 (dsEcK2) u kryen pas ushqyerjes me gjak, nuk ndodhi pjellja, në të cilën pikë kulmi i 20E për shkak të gëlltitjes së gjakut kishte rënë. Në përgjithësi, këto rezultate mbështesin një model që 20E i prodhuar pas thithjes së gjakut mund të shkaktojë pjellje, por vetëm kur blloku i lëshimit të vezëve (EcK2 dhe ndoshta faktorë të tjerë) fiket nga çiftëzimi. As injeksionet e 20E dhe as ato të 3D20E nuk penguan shprehjen e EcK2 tek virgjëreshat (Të dhëna të zgjeruara Fig. 5g), duke sugjeruar që faktorë të tjerë ndërmjetësojnë frenimin e kësaj kinaze. Megjithatë, nivelet e 20E pas ushqyerjes me gjak nuk ishin të mjaftueshme për të shkaktuar shqetësim gjatë çiftëzimit, por u shkaktuan në mënyrë efektive nga titra të lartë të 3D20E të transferuar seksualisht.
Rezultatet tona ofrojnë njohuri të rëndësishme mbi mekanizmat që rregullojnë suksesin riprodhues të A. gambiae. Ka dalë një model ku meshkujt kanë evoluar për të sintetizuar titre të larta të 3D20E, një ekdizon i modifikuar specifik për meshkujt që siguron prejardhjen duke i desensibilizuar femrat për çiftëzim të mëtejshëm. Në të njëjtën kohë, këta vektorë të malaries kanë evoluar gjithashtu një sistem efikas për të aktivizuar 3D20E tek femrat në përgjigje të transferimit seksual të EPP specifike për meshkujt. Sipas njohurive tona, ky është shembulli i parë i një sistemi hormonal steroide të dominuar nga meshkujt dhe femrat që kryen një funksion unik dhe kritik tek insektet. Funksioni i ekdizonit specifik për meshkujt është postuluar, por nuk është demonstruar përfundimisht. Për shembull, një hipotezë kryesisht e hedhur poshtë 18 është se këto funksione mund të kryhen nga pararendësi 20E E1. Dihet mirë se tek Drosophila, monandria shkaktohet nga transferimi seksual i peptideve të vogla seksuale 19,20 që bashkëveprojnë me neuronet që inervojnë traktin riprodhues femëror përmes receptorëve specifikë të peptideve seksuale 21,22. Kërkohet punë e mëtejshme për të përcaktuar rrjedhën e poshtme. kaskadat e sinjalizimit të kontrolluara nga 3D20E te femrat e A. gambiae dhe për të përcaktuar nëse këto kaskada mund të ruhen midis mushkonjave dhe Drosophilës.
Duke pasur parasysh rolin e rëndësishëm të 3D20E në pjellorinë dhe sjelljen femërore të identifikuar në studimin tonë, rrugët që çojnë në sintezën dhe aktivizimin e 3D20E ofrojnë mundësi të reja për strategjitë e ardhshme të kontrollit të mushkonjave, të tilla si gjenerimi i meshkujve sterilë konkurrues në strategjitë e teknologjisë së insekteve sterile. Përdoreni për lirim të egër ose për të imituar 3D20E në lojën e virgjër. Funksioni specifik i mashkullit i 3D20E mund të ketë evoluar kur A. gambiae dhe speciet e tjera Cellia fituan aftësinë për të koaguluar spermën e tyre në tapa çiftëzimi, pasi kjo lejon transferimin efikas të një numri të madh hormonesh dhe enzimash që aktivizojnë hormonet. Nga ana tjetër, evolucioni i 3D20E që zbaton monandrinë ofron një mekanizëm për femrat (përmes shprehjes së lartë të MISO) për të favorizuar aftësinë e tyre riprodhuese në zonat me prevalencë të lartë të malaries, gjë që kontribuon indirekt në transmetimin e Plasmodium. Duke pasur parasysh që femra 20E është treguar se ka efekte të thella në mbijetesën dhe rritjen e P. falciparum në mushkonjat femra Anopheles,24 rrugët e hormoneve steroide si mashkullore ashtu edhe femërore tani janë aspekte kyçe të ndërveprimeve mushkonjë-parazit.
Llojet A. gambiae G3 u rritën në kushte standarde të insekteve (26-28 °C, lagështi relative 65-80%, fotoperiod dritë/errësirë 12:12 orë). Larvat u ushqyen me ushqim pluhur për peshk (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets dhe Tetra Pond Sticks në një raport prej 7:7:2). Mushkonjat e rritura u ushqyen ad libitum me tretësirë dekstroze 10% dhe gjak njerëzor çdo javë (përbërësit e gjakut të studimit). Mushkonjat e virgjëra u morën duke ndarë gjinitë në fazën e pupalit, pasi u ekzaminuan skajet me mikroskopi. Meshkujt që mbanin transgjenin DsRed janë përshkruar më parë.
Eksperimentet e çiftëzimit të detyruar u kryen sipas protokolleve të përshkruara më parë. Për çiftëzimin natyror, femrat e virgjëra 4-ditore u mbajtën në një raport 1:3 me meshkujt e virgjër të pjekur seksualisht për dy netë. Për eksperimentet në të cilat meshkujve iu injektuan dsEPP, bashkë-kafazet përkuan me ditët 3-4 pas injektimit, kur aktiviteti i fosfatazës u hesht maksimalisht (Të dhëna të zgjeruara Fig. 2b).
Indet e mushkonjave, kadavrat e mbetura (pjesa tjetër e trupit) ose i gjithë trupi u disektuan në 100% metanol dhe u homogjenizuan me një sferë (sfera qelqi 2 mm, 2,400 rpm, 90 sek). Sasitë e indeve dhe vëllimet e metanolit ishin si më poshtë: pjesa tjetër e trupit, 50 në 1,000 µl; MAG, 50–100 80 µl; LRT femër, 25–50 80 µl. Precipitati iu nënshtrua një nxjerrjeje të dytë me metanol me të njëjtin vëllim metanoli. Mbetjet qelizore u hoqën me centrifugim. Metanoli nga të dy nxjerrjet u kombinua dhe u tha nën rrjedhën e azotit, pastaj u risuspendua në vëllimet e mëposhtme të 80% metanol në ujë: pjesa tjetër e trupit, 50 µl; MAG dhe LRT femër, 30 µl.
Mostrat u analizuan në një spektrometër mase (ID-X, Thermo Fisher) të lidhur me një instrument LC (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl mostër u injektuan në një kolonë 3 µm, 100 × 4.6 mm (Inspire C8, Dikma) të mbajtur në 25 °C. Fazat mobile për LC ishin A (ujë, 0.1% acid formik) dhe B (acetonitril, 0.1% acid formik). Gradienti LC ishte si më poshtë: 5% B për 1 minutë, pastaj u rrit në 100% B gjatë 11 minutave. Pas 8 minutash në 100%, riekuilibroni kolonën në 5% B për 4 minuta. Shkalla e rrjedhjes ishte 0.3 ml min-1. Jonizimi në burimin MS kryhet me anë të jonizimit me elektrospërkatje të nxehtë në mënyra pozitive dhe negative.
Spektrometri i masës mat të dhënat në diapazonin m/z nga 350 në 680 me rezolucion 60,000 në modalitetin MS të plotë. Të dhënat MS/MS u morën në [M + H]+ (të gjitha objektivat), [M - H2O + H]+ (të gjitha objektivat) dhe [M - H]- (objektivat e fosforiluar). Të dhënat MS/MS u përdorën për të konfirmuar vetitë e ekdizonit të objektivave për të cilët nuk kishte standard të disponueshëm. Për të identifikuar ekdisteroidet jo të synuara, u analizuan të dhënat MS/MS për të gjitha majat HPLC me bollëk relativ >15%. Përcaktoni sasinë duke përdorur kurbat standarde të krijuara nga standardet e pastra (20E, 3D20E) për të llogaritur sasitë absolute ose hollimet e një mostre specifike (të gjitha objektivat e tjera) për të llogaritur ekuivalencën e tyre me sasitë e gjetura në një mashkull. Për 3D20E, përcaktimi sasior u krye duke përdorur shumën e adukteve të mëposhtme: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Të dhënat u nxorën dhe u përcaktuan sasiore duke përdorur Tracefinder (versioni 4.1). Të dhënat MS/MS u analizuan duke përdorur Xcalibur (versioni 4.4). Spektrat MS të E, 20E dhe 3D20E u krahasuan me standardet përkatëse. 3D20E22P u analizua me anë të derivatizimit me reagentin e Girard-it. 20E22P u analizua me anë të raportit m/z.
3D20E22P u pastrua nga MAG. Pastrimi u krye në një shkallë analitike duke përdorur një kromatograf të lëngshëm me performancë ultra (Acquity, Waters) me një detektor kuadrupoli të bazuar në masë (QDa, Acquity, Waters) në të njëjtat kushte LC si analiza HPLC-MS/MS. Mbledhja e fraksioneve u aktivizua kur m/z që korrespondon me 3D20E22P u zbulua në të njëjtën kohë mbajtjeje siç është përcaktuar më parë. Pastërtia e përbërjeve të nxjerra u kontrollua më pas nga HPLC-MS/MS siç përshkruhet më sipër.
ARN-ja totale u nxor nga 10-12 inde riprodhuese ose pjesë të tjera të trupit (pa kokë) duke përdorur reagentin TRI (Thermo Fisher) duke ndjekur udhëzimet e prodhuesit. ARN-ja u trajtua me TURBO DNase (Thermo Fisher). ADNc-ja u sintetizua duke përdorur transkriptazën e kundërt të virusit të leuçemisë murine Moloney (M-MLV RT; Thermo Fisher) duke ndjekur udhëzimet e prodhuesit. Prajmerët për PCR sasiore të transkriptimit të kundërt (RT-qPCR; Tabela e të Dhënave të Zgjeruara 2) u botuan më parë24 ose u projektuan duke përdorur Primer-BLAST26, duke u dhënë përparësi produkteve me madhësi 70-150 bp dhe që përfshinin kryqëzime eksoni-ekson ose prajmerë të çiftit të prajmerëve që ndajnë eksone. Mostrat e ADNc-së nga tre deri në katër replikime biologjike u holluan katër herë në ujë për RT-qPCR. Kuantifikimi u krye në reaksione replikimi prej 15 µl që përmbanin 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), prajmerë dhe 5 µl ADNc të holluar. Reaksionet u kryen në një QuantStudio. Sistemi 6 Pro PCR në kohë reale (Thermo Fisher) dhe të dhënat u mblodhën dhe u analizuan duke përdorur Design and Analysis (versioni 2.4.3). Siç u demonstrua në këtë studim, sasitë relative u normalizuan në gjenin ribosomal RpL19 (AGAP004422), shprehja e të cilit nuk ndryshoi ndjeshëm me ushqyerjen me gjak 27 ose çiftëzimin 3.
Cilësia e ARN-së u kontrollua duke përdorur një Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Bibliotekat me skaje të çiftëzuara Illumina u përgatitën dhe u ekzekutuan në Institutin Broad të MIT dhe Harvard. Leximet e sekuencimit u përputhën me gjenomën A. gambiae (lloji PEST, versioni 4.12) duke përdorur HISAT2 (versioni 2.0.5) me parametra të paracaktuar. Leximet me rezultate të cilësisë së hartëzimit (MAPQ) <30 u hoqën duke përdorur Samtools (versioni 1.3.1). Numri i leximeve të hartuara në gjenet u numërua duke përdorur htseq-count (versioni 0.9.1) me parametra të paracaktuar. Numërimi i normalizuar i leximit u llogarit dhe shprehja diferenciale e gjeneve u analizua duke përdorur paketën DESeq2 (versioni 1.28.1) në R (versioni 4.0.3).
Kandidatët për gjenet modifikuese të ekdizonit u identifikuan duke kërkuar fillimisht gjenomën e A. gambiae duke përdorur algoritmin PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), duke përdorur vlerat fillestare të parametrave me sekuencat e mëposhtme të proteinave të pyetjes: nga Bombyx mori (Nr. i Hyrjes NP_001038956.1), Musca domestica (Nr. i Hyrjes XP_005182020.1, XP_005175332.1 dhe XP_011294434.1) dhe Microplitis demolitor (Nr. i Hyrjes XP_008552646.1 dhe XP_008552645.1) EcK nga B. mori (Nr. i Hyrjes NP_001036900), Drosophila melanogaster (Nr. i Hyrjes NP_651202), Apis mellifera (Nr. i Hyrjes XP_394838) dhe Acyrthosiphon pisum (Nr. i Hyrjes XP_001947166); dhe EPP nga B. mori (Nr. i Hyrjes XP_001947166) NP_001177919.1 dhe NP_001243996.1) dhe EO e D. melanogaster (Nr. i Hyrjes NP_572986.1) (hapi 1). Më pas, filtrohen goditjet bazuar në shprehjen e lartë të ARNi-së (>100 fragmente/kilobazë eksone për milion lexime të hartuara (FPKM) ose >85%) në indin riprodhues (LRT femëror ose MAG) në Gambia (hapi 2). Për të përmirësuar specifikën, ne zgjodhëm enzima kandidate që shprehen gjithashtu në indin riprodhues të A. albimanus, një specie anofele që nuk sintetizon ose transferon ekdizon gjatë çiftëzimit. Gjenet kandidate u filtruan bazuar në shprehjen e ulët (<100 FPKM ose
Femrat e virgjëra 4-6 ditëshe të etiketuara me 15N u detyruan të çiftëzoheshin me meshkuj të virgjër të paetiketuar të përputhur me moshën. Çiftëzimi i suksesshëm u verifikua duke zbuluar tapat e çiftëzimit nën mikroskopinë epifluoreshente. Në 3, 12 dhe 24 hpm, atriumet e 45-55 femrave të çiftëzuara u disektuan në 50 µl tampon bikarbonati amoniumi (pH 7.8) dhe u homogjenizuan me një petë. Homogjenati u centrifugua dhe supernatanti u përzie me 50 µl 0.1% RapiGest (186001860, Waters) në 50 mM bikarbonat amoniumi. Supernatanti dhe peleti nga secila mostër u ngrinë menjëherë në akull të thatë dhe u dërguan gjatë natës në laboratorin MacCoss në Universitetin e Uashingtonit, ku u përfundua përgatitja e mostrës për LC-MS/MS. Risuspendoni peletin në 50 µl 0.1% RapiGest në 50 mM bikarbonat amoniumi dhe aplikojeni me ultratinguj në një banjë uji. Përqendrimi i proteinave të peletit dhe supernatantit u mat me anë të analizës BCA, mostrat u reduktuan me 5 mM ditiotreitol (DTT; Sigma), u alkiluan me 15 mM jodoacetamid (Sigma) dhe u inkubuan në 37 °C (1:0 50) për 1 orë me tripsinizim: raport tripsin:substrat). RapiGest u lizua me shtimin e 200 mM HCl, e ndjekur nga inkubimi në 37 °C për 45 minuta dhe centrifugimi në 14,000 rpm për 10 minuta në 4 °C për të hequr mbeturinat. Mostrat u lanë me anë të nxjerrjes së fazës së ngurtë me dy mënyra (fishekë Oasis MCX, Waters) dhe u risuspenduan në 0.1% acid formik për një përqendrim përfundimtar të proteinave prej 0.33 µg µl-1. Proteomat MAG të paetiketuara u analizuan në mënyrë të ngjashme nga meshkujt e virgjër. U analizuan dy replikime analitike për secilën mostër. Më pas, u analizua 1 µg nga secila. duke përdorur një kolonë silici të shkrirë 25 cm 75 μm me një kurth frit të silicës së shkrirë Kasil1 (PQ) 4 cm të mbushur me rrëshirë Jupiter C12 me fazë të kundërt (Phenomenex) dhe kromatografi të lëngshme 180-minutëshe. Tretje të mostrave – MS/MS u krye në një spektrometër masiv Q-Exactive HF (Thermo Fisher) me një sistem nanoACQUITY UPLC (Waters). Të dhënat e mbledhjes së të dhënave të gjeneruara për secilën ekzekutim u konvertuan në formatin mzML duke përdorur Proteowizard (versioni 3.0.20287) dhe duke përdorur Comet31 (versioni 3.2) kundrejt bazës së të dhënave FASTA që përmbante sekuenca proteinash nga Anopheles gambiae (versioni 54 i VectorBase), Anopheles coluzzi. Një kërkim u krye në Mali-NIH (versioni 54 i VectorBase), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, Mars 2021), RNA-seq të A. gambiae dhe përkthime me tre korniza të ndotësve të njohur njerëzorë. FDR-të e përputhura me hartën e peptideve u përcaktuan duke përdorur Percolator32 (versioni 3.05) me një prag prej 0.01, dhe peptidet u mblodhën në identifikime proteinash duke përdorur kursimin e proteinave në Limelight33 (versioni 2.2.0). Bollëku relativ i proteinave u vlerësua duke përdorur faktorin e bollëkut spektral të normalizuar (NSAF) të llogaritur për secilën proteinë në secilën seri siç është përshkruar më parë. NSAF në lidhje me secilën proteinë u mesatarizua në mostrat nga dy replikime të ndryshme biologjike. Etiketimi 15N maskoi me sukses proteomën femërore, megjithëse një sasi e vogël e proteinës së paetiketuar mund të zbulohej nga virgjëreshat e etiketuara. Ne regjistruam zbulimin e reduktimit të proteinave mashkullore (1-5 spektra) në mostrat e papërpunuara femërore vetëm në seri teknike, ku mostrat e papërpunuara u përdorën pas mostrave mashkullore/çiftëzimi, si rezultat i "mbartjes" së HPLC. Proteinat e rastit të gjetura si 'ndotës' nga virgjëreshat e etiketuara janë renditur në Tabelën Plotësuese 1.
Dy peptide antigjenike, QTTDRVAPAPDQQQ (brenda izotipit PA) dhe MESDGTTPSGDSEQ (brenda izotipit PA dhe PB) në Genscript. Të dy peptidet u kombinuan, pastaj u konjuguuan me proteinën bartëse KLH dhe u injektuan te lepujt e Zelandës së Re. Lepujt u sakrifikuan pas injektimit të katërt dhe IgG totale u izolua me anë të pastrimit të afinitetit. IgG nga lepuri më specifik për EPP u përdor për blot të mëtejshëm western.
Për western blot, MAG (n = 10, ku n përfaqëson numrin e mostrave të mushkonjave biologjikisht të pavarura) dhe LRT femërore (n = 30) nga meshkuj të virgjër 4-ditorë dhe femra të virgjëra ose të çiftëzuara me forcë (<10 pas çiftëzimit), u shtua veçmas një tampon për nxjerrjen e proteinave (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% deoksikolat natriumi; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× koktej frenuesi i proteazës (Roche)). Mostrat u homogjenizuan menjëherë pas diseksionit me një sferë (sfera qelqi 2 mm, 2,400 rpm, 90 sek). Mbetjet e patretshme u hoqën me centrifugim në 20,000 g në 4 °C. Proteinat u përcaktuan me anë të analizës Bradford (Bio-Rad). Pastaj, u morën 20 µg proteinë MAG, 40 µg proteinë LRT dhe 20 µg proteinë e mbetur. denatyrohen dhe ndahen nga 10% Bis-Tris NuPAGE duke përdorur tampon MOPS. Proteinat u transferuan në membranat e fluoridit të polivinilidenit duke përdorur sistemin e transferimit iBlot2 (Thermo Fisher). Membranat u lanë dy herë në 1× PBS-T (0.1% Tween-20 në PBS) dhe më pas u bllokuan në tamponin bllokues Odyssey (Li-Cor) për 1 orë në 22°C. Membranat u tundën gjatë natës në 4°C me antitrup primar poliklonal anti-EPP të lepurit të personalizuar (1:700 në tampon bllokues) dhe antitrup primar monoklonal anti-aktinë të miut MAC237 (Abeam; 1:4,000). Membranat u lanë me PBS-T dhe më pas u inkubuan me antitrupa sekondarë (gomar anti-lepur 800CW dhe dhi anti-mi 680LT (Li-Cor), të dyja 1:20,000) në tampon bllokues që përmbante 0.01% SDS dhe 0.2% Tween-20 për 1 orë në 22 °C. Membranat u lanë me PBS-T dhe u imazhuan me një skaner Odyssey CLx. Imazhet u mblodhën dhe u përpunuan në Image Studio (versioni 5.2). Një brez specifik që korrespondon me izoformën EPP-RA (82 kDa) nuk u zbulua.
Rajonet koduese të EPP (si izoforma AGAP002463-RB që përmban domenin e histidinës fosfatazës, kërkimi i domenit të konservuar NCBI 34) dhe EcK2 (AGAP002181) u klonuan në plazmidin pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); Prajmerët janë renditur në Tabelën 2 të të Dhënave të Zgjeruara. Tetë lidhës GS4 (në tandem) u futën para etiketës C-terminale 6xHis të konstruktit pET-21a(+)-EcK2. Proteinat rekombinante u prodhuan duke përdorur reaksionin e sintezës së proteinave E. coli pa qeliza NEBExpress (New England BioLabs). Proteinat rekombinante u pastruan duke përdorur kolonat NEBExpress Ni spin (New England BioLabs). Proteina e kontrollit të dihidrofolat reduktazës (DHFR) u prodhua duke përdorur shabllonin e ADN-së nga Kit-i i Sintezës së Proteinave E. coli pa qeliza NEBExpress. Proteinat u ruajtën në 50% glicerinë në PBS në -20 °C për deri në 3 muaj.
Aktiviteti i fosfatazës së EPP-së dhe ekstrakteve të indeve u mat duke përdorur 4-nitrofenil fosfat (pNPP; Sigma-Aldrich). Tamponi i reagimit përmbante 25 mM Tris, 50 mM acid acetik, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA dhe 1 mM DTT. Indi u homogjenizua në tamponin e reagimit dhe mbeturinat qelizore u hoqën me anë të centrifugimit. Filloni reagimin duke shtuar enzimë ose ekstrakt indesh në tamponin e reagimit që përmban 2.5 mg ml-1 pNPP. Përzierja e reagimit u inkubua në temperaturë ambienti në errësirë dhe sasia e pNP e konvertuar nga pNPP u përcaktua duke matur absorbimin në 405 nm në kohë të ndryshme.
Për aktivitetin EcK in vitro, proteina u inkubua me 0.2 mg 20E ose 3D20E në 200 µl tampon (pH 7.5) që përmbante 10 mM HEPES-NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP dhe 10 mM MgCl2 për 2 orë në 27 °C. Reaksioni u ndalua duke shtuar 800 µl metanol, më pas u ftoh në -20 °C për 1 orë, pastaj u centrifugua në 20,000 g për 10 minuta në 4 °C. Supernatanti u analizua më pas me HPLC-MS/MS. Për të çaktivizuar me nxehtësi proteinat e përdorura në grupin e kontrollit, proteinat u inkubuan në 50% glicerinë në PBS për 20 minuta në 95 °C.
Për aktivitetin in vitro të EPP-së, proteina u inkubua me 3D20E22P (ekuivalente me sasinë e gjetur në 18 çifte MAG, të pastruara me HPLC-MS/MS) në 100 µl tampon (pH 7.5) që përmbante 25 mM Tris, 50 mM acid acetik, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA dhe 1 mM DTT për 3 orë në 27 °C. Reaksioni u ndalua duke shtuar 400 µl metanol dhe u ftoh në -20 °C për 1 orë, pastaj u centrifugua në 20,000 g për 10 minuta në 4 °C. Supernatanti u analizua me HPLC-MS/MS.
Fragmentet PCR për EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) dhe EcK2 (556 bp) u amplifikuan nga ADNc e përgatitur nga kufoma mushkonjash pa kokë me gjini të përzier. Fragmenti PCR i kontrollit eGFP (495 bp) u amplifikua nga pCR2.1-eGFP i përshkruar më parë; Prajmerët PCR janë renditur në Tabelën 2 të të Dhënave të Zgjeruara. Fragmenti PCR u fut midis promotorëve të përmbysur T7 në plazmidin pL4440. Konstruktet e plazmideve u morën nga E. coli kompetente NEB 5-α (New England Biolabs) dhe u verifikuan me sekuencimin e ADN-së para përdorimit (shih të Dhënat Plotësuese 1 për sekuencën e insertit). Prajmerët e përputhur me promotorin T7 (Tabela 2 e të Dhënave të Zgjeruara) u përdorën për të amplifikuar insertin nga plazmidin e bazuar në pL4440. Madhësia e produktit PCR u konfirmua me anë të elektroforezës së xhelit të agarozës. ARN-ja ds u transkriptua nga shabllonet PCR duke përdorur Megascript T7 Transscription Kit (Thermo Fisher) dhe u pastrua sipas udhëzimeve të prodhuesit me modifikimet e përshkruara më parë.
Për injektimin e dsARN-së, 1,380 ng dsARN (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) u injektuan në një përqendrim prej 10 ng nl-1 në toraksin e meshkujve ose femrave të rritur (Nanoject III, Drummond) brenda 1 dite pas eklosimit. Nivelet e uljes së gjenit u përcaktuan në të paktën tre replikime biologjike me anë të nxjerrjes së ARN-së, sintezës së ADNc-së dhe RT-qPCR. Për injektimin e ekdizonit, femrave të virgjëra 4-ditore ose 6-ditore të ushqyera me gjak u injektuan me 0.13, 0.21 ose 0.63 µg 20E ose 3D20E (Nanoject III, Drummond) në përqendrime prej 1.3, 2.1, përkatësisht, në varësi të modelit eksperimental ose 6.3 ng nl-1. Injektoni 100 nl etanol 10% (vol/vol) në ujë; 100 nl 3D20E22P në 10% etanol (ekuivalent me 75% të sasisë së gjetur në një palë MAG). Mushkonjat u caktuan rastësisht në grupin e injektimit.
Për analizat e pjelljes, femrat 3-ditore u ushqyen ad libitum me gjak njerëzor. Hiqni mushkonjat e ushqyera pjesërisht ose të paushqyera. Në varësi të trajtimit, femrat u vendosën në gota të veçanta pjelljeje për katër netë të paktën 48 orë pas vaktit të gjakut. Vezët u numëruan nën një stereoskop (Stemi 508, Zeiss); për femrat e çiftëzuara, vezët që çelën në larva konsideroheshin pjellore.
Për provat e çiftëzimit, femrave iu lanë të paktën 2 ditë në varësi të trajtimit për të zhvilluar rezistencë ndaj çiftëzimit, dhe meshkujt e tipit të egër të përputhur me moshën u futën më pas në të njëjtin kafaz. Dy netë më vonë, vezikulat e fekonduara femra u disektuan dhe ADN-ja gjenomike u lirua me anë të ngrirjes-shkrirjes dhe sonifikimit në një tampon që përmbante 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA dhe 25 mM NaCl (pH 8.2). Mostrat u inkubuan me Proteinazë K (0.86 µg µl-1) për 15 minuta në 55 °C, e ndjekur nga 10 minuta në 95 °C. Përgatitjet e ADN-së gjenomike të papërpunuar u holluan 10-fish dhe iu nënshtruan zbulimit qPCR të sekuencave të kromozomit Y; prajmerët janë renditur në Tabelën 2 të të Dhënave të Zgjeruara. Mungesa e sekuencës së kromozomit Y tregon se nuk ka çiftëzim.
Për analizat e çiftëzimit të përsëritur, femrat e çiftëzuara me forcë u ekzaminuan për praninë e tapave të çiftëzimit për të konfirmuar statusin e çiftëzimit dhe u lanë 2 ditë për të zhvilluar rezistencë ndaj çiftëzimit në mungesë të meshkujve, siç është përshkruar më parë 36. Meshkujt që mbanin spermë transgjenike DsRed u futën më pas në kafazet e femrave. Dy netë më vonë, vezikulat fekonduese u disektuan nga femrat dhe ADN-ja gjenomike u përgatit siç përshkruhet më sipër dhe iu nënshtrua zbulimit qPCR të transgjenit DsRed; prajmerët janë renditur në Tabelën 2 të të Dhënave të Zgjeruara. Mungesa e transgjenit DsRed tregoi se nuk ndodhi asnjë çiftëzim i përsëritur.
3D20E u sintetizua siç është përshkruar më parë 37. Shkurtimisht, 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) u tret në 10 ml ujë, e më pas u shtuan 30 mg platin i zi (në formë pluhuri, Sigma-Aldrich). Një rrjedhë e lehtë O2 u fut vazhdimisht në përzierjen e reagimit, e cila u përzie në temperaturë ambienti. Pas 6 orësh, u shtuan 30 mL metanol për të ndaluar reagimin. Përzierja u centrifugua për të hequr grimcat e katalizatorit. Supernatanti u avullua deri në tharje në vakuo në temperaturë ambienti. Produkti i tharë i reagimit u tret në 10% etanol dhe metanol për injeksion për analizën HPLC-MS/MS. Shkalla e konvertimit (nga 20E në 3D20E) ishte afërsisht 97% (Fig. 4b), dhe spektri MS i 3D20E të sintetizuar përputhej me atë të gjetur në femrat e çiftëzuara (Fig. 4c).
Legjenda përmban detaje specifike të testeve statistikore të kryera. GraphPad (versioni 9.0) u përdor për të kryer testin e saktë të Fisher-it, testin Mantel-Cox dhe testin t të Student-it. Testet Cochran-Mantel-Haenszel u kryen duke përdorur një skript R të personalizuar (i disponueshëm në https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Shpërndarja e të dhënave u testua për normalitet duke përdorur testin Shapiro-Wilk me një prag rëndësie prej 0.05. Kur të dhënat dështuan në testin e normalitetit, u krye testi Mann-Whitney. Të dhënat e mbijetesës u analizuan duke përdorur testin Mantel-Cox. Paketa DESeq2 (versioni 1.28.1) u përdor për të kryer analizën e shprehjes diferenciale në nivelin e gjenit ARN-seq. Shiriti horizontal në grafik përfaqëson medianën. Një vlerë rëndësie prej P = 0.05 u përdor si prag për të gjitha testet.
Për më shumë informacion mbi modelin e studimit, shihni abstraktin e Raportit të Kërkimeve të Natyrës të lidhur me këtë artikull.
Të dhënat proteomike MS u depozituan në Konsorciumin ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) përmes Repozitorit të Partnerëve PRIDE (https://www.ebi.ac.uk/pride/) me identifikuesin e të dhënave PXD032157.
Seti i të dhënave ARN-seq është depozituar në Bibliotekën Gjithëpërfshirëse të Shprehjes së Gjeneve (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) nën regjistrimin serial GSE198665.
Sete të dhënash shtesë të gjeneruara dhe/ose të analizuara gjatë studimit aktual mund të merren nga autorët përkatës me kërkesë të arsyeshme. Ky artikull ofron të dhënat burimore.
De Loof, A. Ekdisteroide: Steroide seksuale të insekteve të lëna pas dore? Mashkull: Black Box.Insect Science.13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hidroksiekdizon dhe zhvillimi i vezoreve te Anopheles stephens. J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982).
Koha e postimit: 08 korrik 2022