Renditja e proteinave në rrugën sekretuese është thelbësore për ruajtjen e ndarjes së qelizave dhe homeostazës. Përveç renditjes së ndërmjetësuar nga guaska, roli i lipideve në renditjen e kinezinës në procesin e transportit sekretues është një pyetje themelore e hershme që ende nuk është përgjigjur. Këtu, ne kryejmë imazhe 3D të njëkohshme shumëngjyrëshe me rezolucion të lartë në kohë reale për të vërtetuar in vivo se proteinat e saposintetizuara të imobilizuara nga glikozilfosfatidilinozitoli me pjesë shumë të gjata lipidike të ceramideve grumbullohen dhe klasifikohen në endoplazma të specializuara. Vendi i daljes neto, i cili është i ndryshëm nga ai i përdorur nga proteinat transmembranore. Përveç kësaj, ne tregojmë se gjatësia e zinxhirit të ceramideve në membranën e retikulumit endoplazmatik është kritike për këtë selektivitet renditjeje. Studimi ynë ofron provat e para të drejtpërdrejta in vivo për të klasifikuar ngarkesat e proteinave bazuar në gjatësinë e zinxhirit lipidik në vende selektive eksporti në rrugën sekretuese.
Në qelizat eukariote, proteinat e sintetizuara në retikulumin endoplazmatik (RE) më pas renditen gjatë transportit përmes rrugës sekretore për dërgim në destinacionin e tyre të përshtatshëm qelizor (1). Përveç renditjes së ndërmjetësuar nga shtresa, është spekuluar prej kohësh se lipide të caktuara mund të shërbejnë gjithashtu si pika daljeje selektive duke i grupuar ato në domene specifike të membranës që proteina specifike (2-5). Megjithatë, ende mungon prova e drejtpërdrejtë in vivo për të vërtetuar këtë mekanizëm të mundshëm të bazuar në lipide. Për të zgjidhur këtë problem themelor, ne studiuam në maja se si proteinat e ankoruara të glikozilfosfatidilinozitolit (GPI) (GPI-AP) eksportohen në mënyrë të ndryshme nga RE. GPI-AP janë një shumëllojshmëri proteinash sipërfaqësore qelizore të lidhura me lipidet (6, 7). GPI-AP është një proteinë e sekretuar e bashkangjitur në fletëzat e jashtme të membranës plazmatike përmes pjesës së glikolipidit (spiranca GPI). Ato pranojnë spirancat GPI si modifikime konservative post-përkthyese në lumenin RE (8). Pas ngjitjes, GPI-AP kalon nëpër aparatin e Golxhit (5, 9) nga ER në membranën plazmatike. Prania e ankorave të GPI bën që GPI-AP të transportohet veçmas nga proteinat e sekretuara transmembranore (duke përfshirë proteinat e tjera të membranës plazmatike) përgjatë rrugës sekretuese (5, 9, 10). Në qelizat e majasë, GPI-AP ndahen nga proteinat e tjera të sekretuara në retikulumin endoplazmatik dhe më pas paketohen në fshikëza unike të mbështjella nga kompleksi II i proteinave të mbulesës (COPII) (6, 7). Faktorët përcaktues të këtij procesi klasifikimi në procesin e eksportit të ER janë të paqartë, por spekulohet se ky mekanizëm mund të kërkojë lipide, veçanërisht rimodelimin strukturor të pjesës lipidike të spirancës së GPI (5, 8). Në maja, rimodelimin e lipideve të GPI fillon menjëherë pasi GPI ngjitet dhe në shumë raste, shkakton që ceramidi të lidhet me acidin yndyror të ngopur me zinxhir të gjatë prej 26 karboni (C26:0) (11, 12). Ceramida C26 është qeramida kryesore e prodhuar nga qelizat e majasë deri më tani. Ajo sintetizohet në ER dhe pjesa më e madhe e saj eksportohet në aparatin Golgi përmes fshikëzave COPII (13). Eksporti i GPI-AP nga ER kërkon posaçërisht sintezën e vazhdueshme të qeramidit (14, 15), dhe nga ana tjetër, shndërrimi i qeramidit në qeramid fosfati inozitol (IPC) në aparatin Golgi varet nga sinteza e spirancës GPI (16). Studimet biofizike me membrana artificiale kanë treguar se qeramidet me zinxhir acil shumë të gjatë mund të bashkohen për të formuar domene të rregullta me veti fizike unike (17, 18). Këto të dhëna çojnë në hipotezën se qeramida C26 dhe GPI-AP me qeramid C26 përdorin vetitë e tyre fizike për t'u bashkuar në rajone ose rajone të rregullta në mjedisin lipidik relativisht të çrregullt të membranës ER. Ajo përbëhet kryesisht nga glicerolipide të shkurtra dhe të pangopura (C16:1 dhe C18:1) (19, 20). Këto rajone do të përqendrohen në mënyrë selektive në vende specifike të daljes nga ER (ERES), ku qeramidi dhe GPI-AP me bazë qeramide mund të transportohen së bashku në Golgi në të njëjtën fshikëz të dedikuar COPII (5).
Në këtë studim, ne e kemi testuar drejtpërdrejt këtë mekanizëm të bazuar në lipide duke përdorur mikroskopinë e imazherisë konfokale në kohë reale me superrezolucion (SCLIM), e cila është një teknikë e përparuar e mikroskopisë që mund të vëzhgojë njëkohësisht proteinat e etiketuara me fluoreshencë. Imazhet me tre ngjyra dhe tredimensionale (3D) kanë rezolucion dhe shpejtësi jashtëzakonisht të lartë në qelizat e gjalla (21, 22).
Së pari, ne aplikuam teknologjinë SCLIM për të përcaktuar më tej se si GPI-AP normale me grupin e ceramidës C26 u shqyrtua nga proteinat e sekretuara transmembranore pas largimit nga ER në S. cerevisiae. Për të kontrolluar klasifikimin e ER, ne përdorëm një sistem gjenetik që mund të vizualizojë drejtpërdrejt ngarkesën e sintetizuar rishtazi që hyn në ERES in vivo (7, 23). Si ngarkesë, ne zgjodhëm GPI-AP Gas1 të bazuar në ceramide C26 të etiketuar me proteinë fluoreshente jeshile (GFP) dhe proteinën Mid2 të sekretuar transmembranore të etiketuar me proteinë fluoreshente afër infra të kuqe (iRFP), të dyja të cilat synojnë membranën plazmatike (24-26). Në mutantin sec31-1 të ndjeshëm ndaj temperaturës, këto dy ngarkesa shprehen nën një promotor të induktueshëm nga galaktoza dhe një shënues përbërës ERES. Në temperaturë ekstreme (37°C), për shkak se mutacioni sec31-1 ndikon në funksionin e komponentit të mbulesës COPII Sec31 për të penguar mbirjen e COPII dhe eksportin e ER, ngarkesa e sintetizuar rishtazi grumbullohet në ER (23). Pas ftohjes në një temperaturë të ulët (24°C), qelizat mutante sec31-1 u rikuperuan nga zona sekretuese dhe ngarkesa e re sintetike e akumuluar filloi të eksportohej nga ER. Vizualizimi CLIM tregoi se shumica e Gas1-GFP dhe Mid2-iRFP të sintetizuara rishtazi ende grumbulloheshin në ER të qelizave mutante sec31-1 pas inkubimit në 37°C dhe më pas u liruan në 24°C për 5 minuta (Figura 1). Meqenëse Mid2-iRFP shpërndahet në të gjithë membranën ER, dhe Gas1-GFP është i përqendruar dhe i mbledhur në zonën e ndërprerë të membranës ER, shpërndarja e tyre është krejtësisht e ndryshme (Figura 1, A deri në C dhe Filmi S1). Përveç kësaj, siç tregohet në Figurën 1D, grumbulli Gas1-GFP nuk ka Mid2-iRFP. Këto rezultate tregojnë se proteinat GPI-AP dhe transmembranore u ndanë në rajone të ndryshme të membranës ER herët. Grumbulli Gas1-GFP është ngjitur me një ERES specifik të etiketuar me proteinën e mbulesës COPII të mCherry-t Sec13 (Figura 1, E dhe F, dhe filmi S1) (23).
Qelizat sec31-1 shprehin sekrecione të induktuara nga galaktoza, një ceramide me zinxhir të gjatë acil (C26) GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, jeshile) dhe proteinën transmembranore Mid2-iRFP (TMP, blu) dhe ky etiketim konstruktiv ERES Sec13-mCherry (ERES, magenta) u inkubua në 37°C për 30 minuta, u zhvendos në 24°C dhe u imazhua nga SCLIM 5 minuta më vonë. (A deri në C) tregon një imazh përfaqësues të bashkuar ose të vetëm 2D të një plani (A), një imazh projeksioni 2D të 10 seksioneve z (B) ose një imazh 3D të hemisferës qelizore të ngarkesës dhe shënuesve ERES (C). Shiriti i shkallës 1μm (A dhe B). Njësia e shkallës është 0.551μm (C). Gas1-GFP u zbulua në rajone ose grumbuj diskretë të ER, ndërsa Mid2-iRFP u zbulua dhe u shpërnda në të gjithë membranën ER (C). (D) Grafiku tregon intensitetin relativ të fluoreshencës së Gas1-GFP dhe Mid2-iRFP në grumbullin Gas1-GFP përgjatë vijës së bardhë të shigjetës (majtas). AU, njësi arbitrare. (E dhe F) përfaqësojnë imazhin 3D që kombinon shenjën e mallrave dhe ERES. Grumbujt Gas1-GFP u zbuluan pranë ERES specifik. Njësia e shkallës është 0.551μm. (F) Shigjeta e bardhë e plotë shënon grumbullin Gas1-GFP të shoqëruar me ERES. Panelet e mesit dhe të djathtë tregojnë imazhin 3D të zmadhuar të bashkuar dhe një pamje të rrotulluar të grumbullit të zgjedhur Gas1-GFP.
Marrëdhënia e ngushtë hapësinore midis grumbullit Gas1-GFP dhe një ERES specifik tregon se Gas1-GFP mund të hyjë në ERES selektiv, gjë që është e ndryshme nga selektiviteti i përdorur nga Mid2-iRFP për të dalë nga ER. Për të adresuar këtë mundësi, ne përcaktuam raportin ERES vetëm për një ose dy mallra (Figura 2, A deri në C). Ne zbuluam se shumica e ERES (70%) përmbajnë vetëm një lloj ngarkese. Imazhi i poshtëm i Figurës 2C tregon dy shembuj tipikë të ERES me vetëm Gas1-GFP (Figura 1) ose vetëm Mid2-iRFP (Figura 2). Në të kundërt, afërsisht 20% e ERES përmban dy ngarkesa që mbivendosen në të njëjtën zonë. U zbulua se disa ERES (10%) përmbanin dy lloje ngarkesash, por ato ishin të izoluara në zona qartësisht të ndryshme. Prandaj, kjo analizë statistikore tregon se pasi ER të eksportohet, GPI-AP Gas1-GFP dhe ngarkesa transmembranore Mid2-iRFP ndahen në ERES të ndryshme (Figura 2D). Kjo efikasitet i renditjes është shumë në përputhje me analizën e mëparshme biokimike (6) dhe përcaktimin morfologjik (7). Ne gjithashtu mund të vëzhgojmë sjelljen e ngarkesës së karantinës që hyn në ERES (Figura 2E dhe Filmi S2). Figura 2E tregon se vetëm një pjesë e vogël e Gas1-GFP (paneli 3) ose Mid2-iRFP (paneli 4) hyn në ERES nga njëra anë dhe kufizohet në një zonë diskrete. Paneli 5 i Figurës 2E tregon se Gas1-GFP dhe Mid2-iRFP ndonjëherë gjenden në të njëjtin ERES, por ato hyjnë nga anë të ndryshme dhe janë të përqendruara në rajone të ndara që mund të përfaqësojnë fshikëza të ndryshme COPII. Ne gjithashtu konfirmuam se ndarja dhe klasifikimi i vëzhguar i GPI-AP Gas1 me bazë ceramide C26 si ERES selektiv është specifik sepse një ngarkesë tjetër sekretimi transmembranor, proteina e membranës plazmatike e etiketuar me GFP Axl2 (27), tregon sjellje të ngjashme me Mid2-iRFP. (Figura S1 dhe Filmi S3). Axl2-GFP e sintetizuar rishtazi shpërndahet përmes membranës ER si Mid2-iRFP (Figura S1, A dhe B), dhe është e bashkë-lokalizuar me Mid2-iRFP në shumicën e ERES (Figura S1, B deri në D). Panelet 1 dhe 2 të Figurës 1. S1C tregojnë dy shembuj tipikë të ERES ku dy ngarkesa transmembranore mbivendosen. Në këto raste, të dy mallrat hyjnë në ERES së bashku (Figura S1E, Paneli 3 dhe Filmi S3).
Qelizat sec31-1 që shprehin sekrecione të induktueshme nga galaktoza, Gas1-GFP (GPI-AP, jeshile) dhe Mid2-iRFP (TMP, blu) dhe etiketimi përbërës ERES Sec13-mCherry (ERES, magenta) u vendosën në 37°C. Pas inkubimit për 30 minuta në °C, zhvendoseni në 24°C për të çliruar bllokun e sekrecionit dhe imazhi me SCLIM pas 20 minutash. (A deri në C) Imazhe përfaqësuese të projeksionit 2D (A; shiriti i shkallës, 1μm) ose imazhe 3D të hemisferës qelizore (B dhe C; njësia e shkallës, 0.456μm) të ngarkesës dhe 10 seksione z të shënuara nga ERES. Paneli i poshtëm në (B) dhe paneli në (C) shfaqin imazhe të përpunuara për të shfaqur vetëm mallrat e pranishme në ERES (magenta) [Gas1-GFP (gri) dhe Mid2-iRFP (blu e çelët)]. (C) Shigjeta e hapur: ERES mban vetëm një pjesë të ngarkesës (1 deri në 4). Shigjetë gri: ERES përmban ngarkesë të ndarë (5). Shigjetë e bardhë e plotë: ERES përmban ngarkesë të vendosur bashkë. Poshtë: ERES i vetëm i përzgjedhur përmban vetëm Gas1-GFP (1) ose Mid2-iRFP (2). Shiriti i shkallës, 100 nm. (D) Kuantifikimi i fotomikrografisë së përshkruar në (C). Përqindja mesatare e ERES që përmban vetëm një ngarkesë (Gas1-GFP ose Mid2-iRFP), ngarkesë të ndarë dhe ngarkesë mbivendosëse. Në tre eksperimente të pavarura, n = 432 në 54 qeliza. Shiriti i gabimit = SD. Testi t me dy bishta të paçiftuar. *** P = 0.0002. (E) Imazh 3D i ERES të përzgjedhur të ngarkesës së karantinës të shënuar me (C). Gas1-GFP (jeshile) (3) ose Mid2-iRFP (blu) (4) hyn në ERES (magenta) nga njëra anë dhe është i kufizuar në një zonë të vogël brenda ERES. Ndonjëherë, të dy llojet e ngarkesave hyjnë në të njëjtin ERES (5) nga e njëjta anë dhe kufizohen në një zonë të izoluar brenda ERES. Shiriti i shkallës, 100 nm.
Më pas, ne testuam një hipotezë se qeramidi me zinxhir të gjatë acil (C26) i pranishëm në membranën ER nxit grumbullimin dhe renditjen specifike të Gas1 në ERES selektive. Për këtë qëllim, ne përdorëm një lloj të modifikuar të majasë GhLag1, në të cilin dy sintazat endogjene të qeramidit Lag1 dhe Lac1 u zëvendësuan nga GhLag1 (homologu Lag1 i pambukut), duke rezultuar në një lloj majaje me një lloj të membranës qelizore të qeramidit më të shkurtër se lloji i egër (Figura 3A) (28). Analiza e spektrometrisë masive (MS) tregoi se në llojet e tipit të egër, 95% e totalit të qeramidit është qeramid me zinxhir shumë të gjatë (C26), ndërsa në GhLag1, 85% e qeramidit është shumë i gjatë (C18 dhe C16). ), vetëm 2% e qeramidit është qeramid me zinxhir shumë të gjatë (C26). Edhe pse qeramidet C18 dhe C16 janë qeramidet kryesore të zbuluara në membranën GhLag1 deri më tani, analiza MS konfirmoi gjithashtu se spiranca GPI e Gas1-GFP e shprehur në llojin GhLag1 përmban qeramid C26, i cili është i krahasueshëm me lipidet e tipit të egër. Cilësia është e njëjtë (Fig. 3A) (26). Prandaj, kjo do të thotë që enzima e rimodelimit të qeramidit Cwh43 është shumë selektive për qeramidën C26, siç tregohet në Figurën 26, ajo përfshin në mënyrë preferenciale spirancën GPI nga një sasi e vogël e qeramidës C26 në llojin GhLag1. S2 (29). Megjithatë, membrana qelizore e GhLag1 në thelb përmban vetëm qeramidën C18-C16, ndërsa Gas1-GFP ende ka qeramidën C26. Ky fakt e bën këtë lloj një mjet ideal për të zgjidhur posaçërisht problemin e gjatësisë së zinxhirit acil të qeramidës së membranës në ER. Roli hipotetik i klasës dhe renditjes. Pastaj, së pari studiuam aftësinë e C26 Gas1-GFP për t'u grumbulluar në grumbuj në GhLag1 me një alel mutant të ndjeshëm ndaj temperaturës të sec31-1 përmes mikroskopisë konvencionale të fluoreshencës, ku vetëm zinxhiri i gjatë (C18-C16) ekziston në membranën ER Ceramide (Fig. 3). Vërejtëm se në sec31-1, pjesa më e madhe e Gas1-GFP ishte e përqendruar në grumbuj, ndërsa Gas1-GFP në sec31-1 GhLag1 me membranën ER të ceramidës së gjatë (C18-C16) nuk ishte kryesisht e grumbulluar dhe e shpërndarë në të gjithë membranën ER. Për të qenë të saktë, për shkak se grumbullimi i bazuar në ceramide C26 është i lidhur ngushtë me ERES specifike (Figura 1), më pas hetuam nëse ky proces mund të përfshijë edhe funksionin e mekanizmit të proteinave të eksportit të ER. GPI-AP përdor një sistem të veçantë COPII për eksportin e ER, i cili rregullohet në mënyrë aktive nga rimodelimi strukturor i Ted1 i pjesës së glikanit të spirancës GPI (30, 31). GPI-glikani rekombinant njihet më pas nga kompleksi p24 i receptorit transmembranor të ngarkesës, i cili nga ana tjetër rekruton në mënyrë selektive Lst1, i cili është një izoformë specifike e nën-njësisë kryesore të lidhjes së ngarkesës COPII Sec24, duke formuar një fshikëz COPII të pasur me GPI-AP (31-33). Prandaj, ne ndërtuam një mutant të dyfishtë që kombinoi fshirjen e këtyre proteinave të vetme (komponenti i kompleksit p24 Emp24, enzima e rimodelimit të GPI-glikanit Ted1 dhe nën-njësia specifike COPII Lst1) me llojin mutant sec31-1, dhe i studiuam ato. A është e mundur të formohet GFP e grumbullimit Gas1 (Figura 3). Ne vëzhguam se në sec31-1emp24Δ dhe sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP është kryesisht i paklustruar dhe i shpërndarë në të gjithë membranën ER, siç është parë më parë në sec31-1 GhLag1, ndërsa në sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP është si sec31-1. Këto rezultate tregojnë se përveç pranisë së qeramidit C26 në membranën ER, grumbullimi i Gas1-GFP gjithashtu duhet të lidhet me kompleksin p24 dhe nuk kërkon rekrutim specifik të Lst1. Pastaj, ne eksploruam mundësinë që gjatësia e zinxhirit të qeramidit në membranën ER mund të rregullojë lidhjen e Gas1-GFP me p24. Megjithatë, ne zbuluam se prania e qeramidit C18-C16 në membranë nuk ndikon në GPI-glikanet e rindërtuara nga kompleksi p24 (Figurat S3 dhe S4, A dhe B) ose në aftësinë e lidhjes me GPI-AP dhe eksportimit të GPI-AP. Rekrutoni nëntipin COPII Lst1 (Figura S4C). Prandaj, grumbullimi i varur nga qeramida C26 nuk kërkon ndërveprime të proteinave me mekanizma të ndryshëm të eksportit të proteinave ER, por mbështet një mekanizëm alternativ renditjeje të drejtuar nga gjatësia e lipideve. Pastaj, ne analizuam nëse gjatësia e zinxhirit acil të qeramidit në membranën ER është e rëndësishme për klasifikimin efektiv të Gas1-GFP si ERES selektiv. Meqenëse Gas1 në llojin GhLag1 me ceramide me zinxhir të shkurtër largohet nga ER dhe hyn në membranën plazmatike (Figura S5), ne besojmë se nëse renditja drejtohet nga gjatësia e zinxhirit acil të ceramideve, Gas1 në llojin GhLag1 mund të ridrejtohet dhe të kryqëzohet. Mallra ERES me të njëjtën membranë.
(A) Membrana qelizore e GhLag1 përmban kryesisht ceramide më të shkurtra C18-C16, ndërsa spiranca GPI e Gas1-GFP ende ka të njëjtën IPC C26 si qelizat e tipit të egër. Sipër: analiza e gjatësisë së zinxhirit acil të ceramidit në membranën qelizore të llojeve të tipit të egër (Wt) dhe GhLag1p me anë të spektrometrisë masive (MS). Të dhënat përfaqësojnë përqindjen e ceramidit total. Mesatarja e tre eksperimenteve të pavarura. Shiriti i gabimit = SD. Testi t me dy bishta të paçiftuar. **** P <0.0001. Paneli i poshtëm: Analiza MS e gjatësisë së zinxhirit acil të IPC të pranishëm në spirancën GPI të Gas1-GFP (GPI-IPC) të shprehur në llojet e tipit të egër dhe GhLag1p. Të dhënat përfaqësojnë përqindjen e sinjalit total IPC. Mesatarja e pesë eksperimenteve të pavarura. Shiriti i gabimit = SD. Testi t me dy bishta të paçiftuar. ns, jo i rëndësishëm. P = 0.9134. (B) Mikrografi fluoreshente të qelizave sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ dhe sec31-1lst1Δ që shprehin Gas1-GFP të induktuar nga galaktoza u inkubuan në 37°C për 30 minuta dhe u kaluan në mikroskopinë rutinë të fluoreshencës pas 24°C. Shigjeta e bardhë: Grumbulli Gas1-GFP i ER. Shigjeta e hapur: Gas1-GFP i paklustruar është i shpërndarë në të gjithë membranën e ER, duke treguar ngjyrosjen karakteristike të unazës bërthamore të ER. Shiriti i shkallës, 5μm. (C) Kuantifikimi i fotomikrografisë së përshkruar në (B). Përqindja mesatare e qelizave me strukturë të pikëzuar Gas1-GFP. Në tre eksperimente të pavarura, n≥300 qeliza. Shiriti i gabimit = SD. Testi t i paçiftuar me dy bishta. **** P <0.0001.
Për ta zgjidhur drejtpërdrejt këtë problem, ne kryem vizualizimin SCLIM të Gas1-GFP dhe Mid2-iRFP në GhLag1 me alelin mutant sec31-1 të ndjeshëm ndaj temperaturës (Figura 4 dhe Filmi S4). Pasi ER u mbajt në 37°C dhe më pas u lirua në 24°C, pjesa më e madhe e Gas1-GFP të sintetizuar rishtazi nuk u grumbullua dhe u shpërnda në të gjithë membranën ER, siç është vërejtur nga mikroskopët konvencionalë (Figura 4, A dhe B). Përveç kësaj, një përqindje e madhe e ERES (67%) përfshin dy lloje ngarkesash të vendosura bashkë në të (Figura 4D). Panelet 1 dhe 2 të Figurës 4C tregojnë dy shembuj tipikë të ERES me Gas1-GFP dhe Mid2-GFP që mbivendosen. Përveç kësaj, të dy mallrat u rekrutuan në të njëjtin ERES (Figura 4E, paneli 3 dhe filmi S4). Prandaj, rezultatet tona tregojnë se gjatësia e zinxhirit acil të ceramidit në membranën ER është një përcaktues i rëndësishëm i grumbullimit dhe klasifikimit të proteinave ER.
Qelizat Sec31-1 GhLag1 që shprehin sekrecione të induktuara nga galaktoza, Gas1-GFP (GPI-AP, jeshile) dhe Mid2-iRFP (TMP, blu) dhe Sec13-mCherry përbërëse e shënuar me ERES (ERES, magenta). Inkubojeni në 37°C. Vazhdoni për 30 minuta, uleni në 24°C për të lëshuar sekrecionet dhe imazhe me SCLIM pas 20 minutash. (A deri në C) Imazhe përfaqësuese të projeksionit 2D (A; shiriti i shkallës, 1μm) ose imazhe 3D të hemisferës qelizore (B dhe C; njësia e shkallës, 0.45μm) të 10 seksioneve z të shënuara nga ngarkesa dhe ERES. Paneli i poshtëm në (B) dhe paneli në (C) shfaqin imazhe të përpunuara për të shfaqur vetëm mallrat e pranishme në ERES (magenta) [Gas1-GFP (gri) dhe Mid2-iRFP (blu e çelët)]. (C) Shigjetë e mbushur me të bardhë: ERES, mallrat mbivendosen. Shigjeta e hapur: ERES përmban vetëm një artikull. Paneli i poshtëm: ERES i përzgjedhur ka mallra mbivendosëse (1 dhe 2) të shënuara në (C). Shiriti i shkallës, 100 nm. (D) Kuantifikimi i fotomikrografisë së përshkruar në (C). Në njësitë sec31-1 dhe sec31-1 GhLag1, përfshihet vetëm një ngarkesë (Gas1-GFP ose Mid2-iRFP), dhe përqindja mesatare e ERES për ngarkesën e izoluar dhe ngarkesën mbivendosëse. Në tre eksperimente të pavarura, n = 432 në 54 qeliza (sec31-1) dhe n = 430 në 47 qeliza (sec31-1 GhLag1). Shiriti i gabimit = SD. Testi t me dy bishta të paçiftuar. *** P = 0.0002 (sec31-1) dhe ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Imazh 3D i ERES të përzgjedhur me ngarkesë mbivendosëse (3) të shënuar në (C). Gas1-GFP (jeshile) dhe Mid2-iRFP (blu) i afrohen ERES (purpurt) nga e njëjta anë dhe qëndrojnë në të njëjtën zonë të kufizuar ERES. Shiriti i shkallës, 100 nm.
Ky studim ofron prova të drejtpërdrejta in vivo se ngarkesat e proteinave me bazë lipidi klasifikohen në vende selektive eksporti në rrugën sekretuese dhe zbulon rëndësinë e gjatësisë së zinxhirit acil për selektivitetin e klasifikimit. Duke përdorur një teknikë të fuqishme dhe të përparuar të mikroskopisë të quajtur SCLIM, ne demonstruam Gas1-GFP të sintetizuar rishtazi (një GPI-AP kryesore e membranës plazmatike me një pjesë lipidi të ceramidit shumë të gjatë të zinxhirit acil (C26)) në maja. Rajonet e grupuara në ER diskrete shoqërohen me ERES specifike, ndërsa proteinat e sekretuara transmembranore shpërndahen në të gjithë membranën ER (Figura 1). Përveç kësaj, këto dy lloje mallrash hyjnë në ERES të ndryshme në mënyrë selektive (Figura 2). Gjatësia e zinxhirit acil të ceramidit qelizor në membranë zvogëlohet nga C26 në C18-C16, grumbulli Gas1-GFP ndërpritet në rajonin diskret ER, dhe Gas1-GFP ridrejtohet për t'u larguar nga ER me proteinën transmembranore përmes të njëjtit ERES (Figura 3 dhe Figura 3). 4).
Edhe pse GPI-AP përdor një mekanizëm të specializuar proteinash për të dalë nga ER, ne zbuluam se ndarja e varur nga qeramida C26 nuk mbështetet në ndërveprimet diferenciale të proteinave që mund të çojnë në specializimin e ERES (Figurat S4 dhe S5). Në vend të kësaj, gjetjet tona mbështesin një mekanizëm alternativ klasifikimi të drejtuar nga grumbullimi i proteinave me bazë lipidesh dhe përjashtimi pasues i ngarkesave të tjera. Vëzhgimet tona tregojnë se rajoni ose grumbulli Gas1-GFP i shoqëruar me një ERES specifik nuk ka proteinën Mid2-iRFP të sekretuar transmembranore, gjë që tregon se grumbulli GPI-AP i varur nga qeramida C26 do të lehtësojë hyrjen e tyre në ERES përkatëse, dhe në të njëjtën kohë, do të përjashtojë sekretimet transmembranore. Sekrecionet hyjnë në këtë ERES të veçantë (Figurat 1 dhe 2). Në të kundërt, prania e qeramideve C18-C16 në membranën ER nuk shkakton që GPI-AP të formojë rajone ose grumbullime, kështu që ato nuk përjashtojnë ose zëvendësojnë proteinat e sekretuara transmembranore në të njëjtin ERES (Figurat 3 dhe 4). Prandaj, ne propozojmë që ceramida C26 nxit ndarjen dhe klasifikimin duke lehtësuar grumbullimin e proteinave të lidhura me ERES specifike.
Si të arrihet ky grumbullim i varur nga qeramida C26 në një zonë specifike të ER? Tendenca e qeramidës së membranës për t'u ndarë anash mund të shkaktojë që GPI-AP dhe qeramida C26 të formojnë lipide të vogla dhe të renditura menjëherë në mjedisin lipidik më të çrregullt të membranës ER që përmban gliceropidi më të shkurtra dhe të pangopura. Grumbuj cilësorë (17, 18). Këto grumbuj të vegjël të përkohshëm mund të bashkohen më tej në grumbuj më të mëdhenj dhe më të qëndrueshëm pas lidhjes me kompleksin p24 (34). Në përputhje me këtë, ne treguam se C26 Gas1-GFP duhet të bashkëveprojë me kompleksin p24 për të formuar grumbuj më të mëdhenj të dukshëm (Figura 3). Kompleksi p24 është një oligomer heterozigot i përbërë nga katër proteina të ndryshme transmembranore p24 në maja (35), i cili siguron lidhje shumëvalente, e cila mund të çojë në lidhjen kryq të grumbujve të vegjël GPI-AP, duke gjeneruar kështu grumbull më të madh të qëndrueshëm (34). Ndërveprimi midis ektodomineve të proteinave të GPI-AP mund të kontribuojë gjithashtu në grumbullimin e tyre, siç tregohet gjatë transportit të tyre Golgi në qelizat epiteliale të polarizuara të gjitarëve (36). Megjithatë, kur qeramida C18-C16 është e pranishme në membranën ER, kur kompleksi p24 lidhet me Gas1-GFP, nuk do të formohen grumbuj të mëdhenj të veçantë. Mekanizmi themelor mund të varet nga vetitë specifike fizike dhe kimike të qeramidit me zinxhir të gjatë acil. Studimet biofizike të membranave artificiale tregojnë se megjithëse qeramidet me zinxhir të gjatë acil (C24) dhe të shkurtër (C18-C16) mund të shkaktojnë ndarje të fazave, vetëm qeramidet me zinxhir të gjatë acil (C24) mund të nxisin Lakim të lartë dhe përkulje të filmit për të riformësuar filmin. Përmes referencës së ndërsjellë (17, 37, 38). Është treguar se spiralja transmembranore e TMED2, homologu njerëzor i Emp24, bashkëvepron në mënyrë selektive me sfingomielinën me bazë ceramide C18 në lobulat citoplazmatike (39). Duke përdorur simulime të dinamikës molekulare (MD), zbuluam se si ceramidet C18 ashtu edhe C26 grumbullohen rreth lobulave citoplazmatike të helikës transmembranore Emp24, dhe ato kanë preferenca të ngjashme (Figura S6). Vlen të përmendet se kjo tregon se helika transmembranore e Emp24 mund të çojë në shpërndarje asimetrike të lipideve në membranë. Ky është një rezultat i kohëve të fundit i bazuar në qelizat e gjitarëve. Simulime të ngjashme MD tregojnë gjithashtu praninë e lipideve eterike (40). Prandaj, ne spekulojmë se ceramidet C26 në dy lobulat e ER26 pasurohen lokalisht. Kur GPI-AP në lobulat luminale lidhet drejtpërdrejt me p24 shumëvalente dhe akumulimi i ceramideve C26 rreth p24 në lobulat citoplazmatike, kjo mund të nxisë grumbullimin shoqërues të proteinave dhe lakimi i membranës gjenerohet përmes gishtërinjve (41), duke bërë që GPI-AP të ndahet në rajone diskrete ngjitur me ERES, gjë që gjithashtu favorizon rajonet shumë të lakuara të membranës ER (42). Raportet e mëparshme mbështetën mekanizmin e propozuar (43, 44). Lidhja shumëvalente e oligolektinave, patogjenëve ose antitrupave ndaj glikosfingolipideve (GSL) me bazë ceramide në membranën plazmatike shkakton agregim të madh të GSL, rrit ndarjen e fazave dhe shkakton deformim dhe internalizim të membranës (44). Iwabuchi etj. (43) U zbulua se në prani të zinxhirëve të gjatë acil (C24) por jo të shkurtër (C16), ligandi shumëvalent i lidhur me laktozilceramidin GSL shkaktoi formimin e grumbujve të mëdhenj dhe invaginimin e membranës, dhe transduksioni i sinjalit i ndërmjetësuar nga Lyn në fletëza të citoplazmës ndërthuret nga zinxhirët acil në neutrofilet e çiftëzuara.
Në qelizat epiteliale të polarizuara të gjitarëve, përqendrimi i rrjetit anti-Golgi (TGN) në nivelin e membranës plazmatike apikale kontrollon ndarjen dhe renditjen e GPI-AP (10, 45). Ky grumbullim drejtohet nga oligomerizimi i GPI-AP (36), por mund të varet edhe nga gjatësia e zinxhirit të ceramidës që gjejmë në maja. Megjithëse GPI-AP i gjitarëve ka një spirancë të bazuar në lipide eterike, dhe struktura e saj kimike është shumë e ndryshme nga qeramida me zinxhir acil shumë të gjatë, një studim i kohëve të fundit zbuloi se të dy lipidet kanë veti dhe funksione fizike dhe kimike të ngjashme evolucionarisht (40). Prandaj, pjesa lipidike eterike në qelizat e gjitarëve mund të jetë e ngjashme me qeramiden C26 në maja, dhe roli i saj është të shoqërohet me qeramiden me zinxhir të gjatë në membranë për të nxitur grumbullimin dhe renditjen e GPI-AP. Megjithëse kjo mundësi ende duhet të testohet drejtpërdrejt, gjetjet e mëparshme mbështesin që transporti i qeramidës me zinxhir të gjatë acil në trupin e Golxhit nuk kryhet nga proteinat citoplazmatike të transferimit, por varet nga sinteza e spirancave GPI si maja. Prandaj, mekanizmi konservator evolucionar duket se është në gjendje të transportojë në mënyrë selektive ceramidën me zinxhir shumë të gjatë acil dhe GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) në të njëjtën fshikëz transporti.
Në sistemet qelizore epiteliale të polarizuara të majave dhe gjitarëve, grumbullimi dhe ndarja e GPI-AP nga proteinat e tjera të membranës plazmatike ndodhin të gjitha para se të arrijnë sipërfaqen e qelizës. Paladino et al. (48) zbuluan se në TGN-në e qelizave epiteliale të polarizuara të gjitarëve, grumbullimi i GPI-AP nuk është i nevojshëm vetëm për klasifikimin selektiv të GPI-AP në membranën plazmatike apikale, por gjithashtu rregullon organizimin e grumbullimit të GPI-AP dhe aktivitetin e tij biologjik. Sipërfaqja e qelizës. Në maja, ky studim tregoi se grumbullimi i varur nga qeramida C26 GPI-AP në ER mund të rregullojë organizimin e grumbullimit dhe aktivitetin funksional të GPI-AP në membranën plazmatike (24, 49). Në përputhje me këtë model, qelizat GhLag1 janë alergjike ndaj frenuesve të GPI ose ilaçeve që ndikojnë në integritetin e murit qelizor (28), dhe nevoja për grumbullime funksionale Gas1-GFP (49) të qeramidës së majës të projektuar në çiftëzimin e qelizave të majave tregon G Pasojat e mundshme fiziologjike të qelizave hLag1. Gabim i GPI-AP. Megjithatë, testimi i mëtejshëm nëse organizimi funksional i sipërfaqes qelizore është programuar nga ER me anë të një metode renditjeje bazuar në gjatësinë e lipideve do të jetë objekt i hulumtimeve tona të ardhshme.
Llojet Saccharomyces cerevisiae të përdorura në këtë punim janë renditur në Tabelën S1. Llojet MMY1583 dhe MMY1635 të SCLIM për imazhe të qelizave të gjalla u ndërtuan në sfondin e W303. Këto llame që shprehin Sec13-mCherry me një etiketë proteine ​​fluoreshente u ndërtuan duke përdorur një metodë të bazuar në reaksion zinxhir polimerazë (PCR) me plazmidin pFA6a si shabllon (23). Lloji që shpreh Mid2-iRFP i etiketuar me proteinë fluoreshente nën kontrollin e promotorit GAL1 u ndërtua si më poshtë. Amplifikimi PCR i sekuencës iRFP-KanMx nga vektori pKTiRFP-KAN (dhuratë e E. O'Shea, numri i plazmidit Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; identifikuesi i burimit të kërkimit (RRID): Addgene_64687) Dhe u futën në C-terminalin e Mid2 endogjen. Pasi sekuenca e gjenomit Mid2-iRFP u amplifikua dhe u klonua në promotorin GAL1, ajo u integrua në vendin Not I-Sac I të plazmidit të integrimit pRS306. Plazmidi pRGS7 që rezultoi u linearizua me Pst I për t'u integruar në lokusin URA3.
Gjeni i bashkimit Gas1-GFP shprehet nën kontrollin e promotorit GAL1 në plazmidin e centromerit (CEN), i cili është ndërtuar si më poshtë. Sekuenca Gas1-GFP u amplifikua me PCR nga plazmidin pRS416-GAS1-GFP (24) (dhuratë e L. Popolo) dhe u klonua në vendin Xma I–Xho I të plazmidit CEN pBEVY-GL LEU2 (dhuratë e C). Miller; numri i plazmidit Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Plazmidit që rezultoi iu dha emri pRGS6. Gjeni i bashkimit Axl2-GFP shprehet gjithashtu nën kontrollin e promotorit GAL1 të vektorit pBEVY-GL LEU2, dhe ndërtimi i tij është si më poshtë. Sekuenca Axl2-GFP u amplifikua nga plazmidi pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) me anë të PCR-së dhe u klonua në vendin Bam HI-Pst I të vektorit pBEVY-GL LEU2. Plazmidi që rezultoi u emërua pRGS12. Sekuenca e oligonukleotideve të përdorura në këtë studim është renditur në Tabelën S2.
Shtami u plotësua me 0.2% adeninë dhe 2% glukozë [YP-dekstrozë (YPD)], 2% medium protein p (YP) të ekstraktit të majasë të pasur me rafinozë [YP-rafinozë] (1% ekstrakt majaje dhe 2% proteinë ept). (YPR)] ose 2% galaktozë [YP-galaktozë (YPG)] si burim karboni, ose në një medium minimal sintetik (0.15% bazë azoti majaje dhe 0.5% sulfat amoniumi) për të plotësuar aminoacidet dhe bazat e duhura të nevojshme për ushqyerjen, dhe që përmbante 2% glukozë (medium minimal glukoze sintetike) ose 2% galaktozë (medium minimal galaktoze sintetike) si burim karboni.
Për imazhe në kohë reale, qelizat mutante sec31-1 të ndjeshme ndaj temperaturës që shprehin konstruktin nën promotorin GAL1 u rritën në mjedis YPR në 24°C gjatë natës deri në fazën mesatare log. Pas induksionit në YPG në 24°C për 1 orë, qelizat u inkubuan në SG në 37°C për 30 minuta dhe më pas u transferuan në 24°C për t'u çliruar nga blloku i sekretimit. Konkanavalina A u përdor për të fiksuar qelizat në një lamë qelqi dhe u imazhua nga SCLIM. SCLIM është një kombinim i mikroskopit fluoreshent të përmbysur Olympus IX-71 dhe lentes me vaj me aperturë numerike UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), skanerit konfokal me disk rrotullues me shpejtësi të lartë dhe raport të lartë sinjal-zhurmë (Yokogawa Electric), spektrometrit të personalizuar dhe ftohjes së personalizuar. Intensifikuesi i imazhit të sistemit (Hamamatsu Photonics) mund të ofrojë një sistem lentesh zmadhuese me një zmadhim përfundimtar prej ×266.7 dhe një kamerë të pajisjes së çiftëzuar me ngarkesë që shumëfishon elektronet (Hamamatsu Photonics) (21). Marrja e imazhit kryhet nga një softuer i personalizuar (Yokogawa Electric). Për imazhet 3D, ne përdorëm një aktivizues piezoelektrik të bërë me porosi për të vibruar lenten objektive vertikalisht dhe mblodhëm pjesët optike 100 nm larg njëra-tjetrës në një pirg. Imazhi Z-stack konvertohet në të dhëna voxel 3D, dhe funksioni teorik i shpërndarjes së pikës i përdorur për mikroskopin konfokal me disk rrotullues përdoret për përpunimin e dekonvolucionit nga softueri Volocity (PerkinElmer). Duke përdorur programin Volocity për të përcaktuar automatikisht pragun për analizën e bashkë-lokacionit, u mat ERES duke përfshirë edhe ngarkesën. Analiza e skanimit të linjës u krye duke përdorur programin MetaMorph (Molecular Devices).
Përdorni programin GraphPad Prism për të përcaktuar rëndësinë statistikore. Për testin t të Studentit me dy kahe dhe testin e analizës së zakonshme njëkahëshe të variancës (ANOVA), ndryshimet midis grupeve konsiderohen të kenë një ndikim të rëndësishëm në P <0.05 (*).
Për mikroskopinë fluoreshente të Gas1-GFP, qelizat e fazës logaritmike u rritën gjatë natës në YPD dhe u mblodhën me anë të centrifugimit, u lanë dy herë me tretësirë ​​fiziologjike të tamponuar me fosfat dhe u inkubuan në akull për të paktën 15 minuta, dhe më pas u vazhdua nën mikroskop siç është përshkruar më parë Kontrolloni (24). Për marrjen e informacionit u përdor mikroskopi Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) i pajisur me një lente objektivi, filtër L5 (GFP), kamerë Hamamatsu dhe softuer Application Suite X (LAS X).
Mostrat u denatyruan me tampon mostre SDS në 65°C për 10 minuta dhe më pas u ndanë me anë të elektroforezës së xhelit SDS-poliakrilamid (PAGE). Për analizën imunoblotting, u ngarkuan 10 μl mostër për secilën korsi. Antitrupi primar: Përdorni anti-Gas1 poliklonal lepuri në një hollim prej 1:3000, anti-Emp24 poliklonal lepuri në një hollim prej 1:500 dhe anti-GFP poliklonal lepuri (një dhuratë nga H. Riezman) në një hollim prej 1:3000. Antitrupi monoklonal anti-Pgk1 i miut u përdor në një hollim prej 1:5000 (një dhuratë nga J. de la Cruz). Antitrupi sekondar: Imunoglobulinë G (IgG) e dhisë anti-lepuri e konjuguar me peroksidazë rrikë (HRP) e përdorur në një hollim prej 1:3000 (Pierce). Anti-IgG e dhisë anti-mi e konjuguar me HRP u përdor në një hollim prej 1:3000 (Pierce). Zona e përgjigjes imune u vëzhgua me metodën e kemilumineshencës së reagentit SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Siç përshkruhet në (31), një eksperiment imunoprecipitimi natyror u krye në fraksionin e pasuruar të ER. Shkurt, lani qelizat e majasë me tampon TNE [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenilmetilsulfonil fluorid dhe përzierje frenuesish proteaze) në 600 nm (OD600) në dendësi optike 100 dy herë. Ai u thye me sfera qelqi, dhe më pas mbeturinat qelizore dhe sferat e qelqit u hoqën me centrifugim. Supernatanti u centrifugua më pas në 17,000 g për 15 minuta në 4°C. Peleta u risuspendua në TNE dhe saponina e digitalis u shtua në një përqendrim përfundimtar prej 1%. Suspensioni u inkubua për 1 orë me rrotullim në 4°C, dhe më pas përbërësit e patretshëm u hoqën me centrifugim në 13,000 g në 4°C për 60 minuta. Për imunoprecipitimin e Gas1-GFP, së pari para-inkuboni mostrën me sfera agaroze bosh (ChromoTek) në 4°C për 1 orë dhe më pas inkuboni me GFP-Trap_A (ChromoTek) në 4°C për 3 orë. Sferat e imunoprecipituara u lanë pesë herë me TNE që përmbante 0.2% digoksigeninë, u eluuan me tampon mostre SDS, u ndanë në SDS-PAGE dhe u analizuan me imunoblotim.
Siç përshkruhet në (31), përcaktimi i lidhjes kryqëzuese u krye në fraksionin e pasuruar të ER-së. Shkurtimisht, fraksioni i pasuruar i ER-së u inkubua me 0.5 mM ditiobis(succinimidyl propionat) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, SHBA; 20°C, 20 min). Reaksioni i lidhjes kryqëzuese u shua duke shtuar glicinë (përqendrim përfundimtar 50 mM, 5 minuta, 20°C).
Siç është përshkruar më parë (50), u krye analiza MS e qeramidit në llojet e egra dhe GhLag1. Shkurt, qelizat u rritën në fazën eksponenciale (3 deri në 4 njësi OD600/ml) në YPD në 30°C, dhe u mblodhën 25×107 qeliza. Metabolizmi i tyre shuhet me acid trikloroacetik. Përdorni tretës nxjerrjeje [etanol, ujë, eter, piridinë dhe hidroksid amoni 4.2 N (15:15:5:1:0.018 v/v)] dhe 1.2 nmol të cilësisë së brendshme të ceramidit standard C17 (860517, lipid polar Avanti)). Përdorni reagentin monometilaminë [metanol, ujë, n-butanol dhe tretësirë ​​metilamine (4:3:1:5 v/v)] për të kryer hidrolizë të lehtë alkaline të ekstraktit, dhe më pas përdorni n-butanol të ngopur me ujë për të çkripëzuar. Së fundmi, ekstrakti u risuspendua në një tretës në modalitetin pozitiv [kloroform/metanol/ujë (2:7:1) + 5 mM acetat amoni] dhe u injektua në spektrometrin e masës. Monitorimi i shumëreaksioneve (MRM) u krye për identifikimin dhe përcaktimin sasior të molekulave të sfingolipideve. Spektrometri i masës kuadrupole terciare TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) është i pajisur me një burim robotik joni nanoflow Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) për analizën e lipideve. Energjia e përplasjes është optimizuar për secilën kategori të ceramidës. Të dhënat MS u morën në modalitetin pozitiv. Për secilën replikim biologjik, sinjali lipidik është mediana e tre matjeve të pavarura.
Siç përshkruhet në (31), qelizat (800×107) që shprehin Gas1-GFP iu nënshtruan imunoprecipitimit natyror. Gas1-GFP i pastruar u nda me SDS-PAGE dhe u transferua në një membranë me fluorid poliviniliden (PVDF). Proteina u vizualizua duke ngjyrosur PVDF me të zezën e amideve. Banda Gas1-GFP u pre nga PVDF dhe u larë 5 herë me metanol dhe një herë me ujë të gradës kromatografi e lëngshme-MS (LC-MS). Duke inkubuar shiritin e membranës me 500 μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), tampon dhe 500 μl përzierje të sapotretur të nitritit të natriumit 1 M në 37°C për 3 orë, fraksioni lipidik lirohet nga Gas1-GFP dhe lizohet. Lirimi i ceramidit të fosfatit të inozinës midis glukozaminës dhe inozitolit (51). Pas kësaj, shiriti i membranës u larë katër herë me ujë të gradës LC-MS, u tha në temperaturë ambienti dhe u ruajt në një atmosferë azoti në -80°C deri në analizë. Si kontroll, për secilin eksperiment u përdor një mostër bosh e membranës PVDF. Lipidi i nxjerrë nga Gas1-GFP u analizua më pas me MS siç përshkruhet (50). Shkurt, shiritat PVDF që përmbanin GPI-lipid u risuspenduan në 75μl tretës negativ të mykut [kloroform/metanol (1:2) + 5 mM acetat amoni] dhe iu nënshtruan analizës së jonizimit me elektrospërkatje (ESI)-MRM/MS të specieve të sfingolipideve (TSQ Vantage). Në këtë rast, të dhënat MS u morën në modalitetin e joneve negative.
Siç u përmend më parë, pjesa lipidike e spirancës GPI u nda nga GPI-AP i shënuar me [3H]-inozitol (16). Lipidet u ndanë me kromatografi me shtresë të hollë duke përdorur një sistem tretësish (55:45:10 kloroform-metanol-0.25% KCl) dhe u vizualizuan duke përdorur FLA-7000 (Fujifilm).
Qelizat që shprehin Gas1-GFP (600×107) u lanë dy herë me tampon TNE me tampon TNE, u thyen me sfera qelqi dhe më pas u centrifuguan për të hequr mbeturinat qelizore dhe sferat e qelqit. Supernatanti më pas u centrifugua në 17,000 g për 1 orë në 4°C. Peleta u la në TNE dhe u inkubua me 1 U PI-PLC (Invitrogen) në TNE që përmbante 0.2% saponinë digitalis për 1 orë në 37°C. Pas trajtimit me enzimë, membrana u hoq me centrifugim në 17,000 g në 4°C për 1 orë. Për të imunoprecipituar Gas1-GFP, supernatanti u inkubua me GFP-Trap_A (ChromoTek) në 4°C gjatë natës. Gas1-GFP e pastruar e ndarë nga SDS-PAGE u ngjyros me blu të shkëlqyer Coomassie. Brezi i ngjyrosjes Gas1-GFP u pre nga ngjyra gri që rrethon ujësjellësin, dhe më pas, pas alkilimit me jodoacetamid dhe reduktimit me ditiotreitol, u krye tretja në xhel me tripsinë. Ekstraktoni dhe thani peptidet triptike dhe peptidet me GPI-glikane. Peptidi i tharë u tret në 20 μl ujë. Injektoni një pjesë (8 μl) në LC. Një kolonë oktadecilsilani (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; diametri i brendshëm 150 mm×1.0 mm; Nomura Chemical, Prefektura Aichi, Japoni) u përdor për të ndarë peptidet në kushte specifike të gradientit. Faza mobile është tretësi A (0.08% acid formik) dhe tretësi B (0.15% acid formik në 80% acetonitril). Një sistem Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) u përdor për të eluuar kolonën me tretësin A brenda 55 minutave me një shpejtësi rrjedhjeje prej 50 μl min-1 për 5 minuta, dhe më pas përqendrimi i tretësit B u rrit në 40%. , Shtetet e Bashkuara). Eluati u fut vazhdimisht në burimin e joneve ESI, dhe peptidet triptike dhe peptidet me GPI-glikane u analizuan nga LTQ Orbitrap XL (spektrometër masiv hibrid linear jonik kurth-orbitrap; Thermo Fisher Scientific). Në konfigurimin MS, tensioni i burimit kapilar u vendos në 4.5 kV, dhe temperatura e kapilarit të transferimit u mbajt në 300°C. Tensioni kapilar dhe tensioni i lentes së tubit u vendosën në 15 V dhe 50 V, përkatësisht. Të dhënat MS u morën në modalitetin e joneve pozitive (rezolucioni 60,000; saktësia e masës 10 pjesë për milion) në një diapazon mase prej 300/m/z raporti masë/ngarkesë (m/z) 3000. Të dhënat MS/MS merren përmes kurthit jonik në LTQ Orbitrap XL [3 shifrat e para nga të cilat varen të dhënat, disociimi i shkaktuar nga përplasja (CID)].
Simulimet MD u kryen duke përdorur softuerin GROMACS (52) dhe fushën e forcës MARTINI 2 (53-55). Ndërtuesi i Membranës CHARMM GUI (56, 57) u përdor më pas për të ndërtuar një shtresë të dyfishtë që përmban dioleoilfosfatidilkolinë (DOPC) dhe Cer C18 ose DOPC dhe Cer C26. Topologjia dhe koordinatat e Cer C26 rrjedhin nga DXCE duke hequr sferat shtesë nga bishti i sfingozinës. Përdorni procesin e përshkruar më poshtë për të balancuar shtresën e dyfishtë dhe për ta ekzekutuar atë, pastaj përdorni koordinatat e fundit të sistemit për të ndërtuar një sistem që përmban Emp24. Domeni transmembranor i majasë Emp24 (mbetjet 173 deri në 193) u ndërtua si një α-spirale duke përdorur strukturën molekulare të mjetit vizual MD (VMD) (58). Pastaj, pas heqjes së lipideve mbivendosëse, proteina u granulua trashë dhe u fut në shtresën e dyfishtë duke përdorur CHARMM GUI. Sistemi përfundimtar përmban 1202 DOPC dhe 302 Cer C26 ose 1197 DOPC dhe 295 Cer C18 dhe Emp24. Jonizoni sistemin në një përqendrim prej 0.150M. U bënë katër replikime të pavarura për dy përbërje dyshtresore.
Shtresa e dyfishtë lipidike balancohet duke përdorur procesin CHARMM GUI, i cili përfshin minimizimin dhe më pas balancimin e 405,000 hapave, ku kufizimet e pozicionit zvogëlohen dhe eliminohen gradualisht, dhe hapi kohor rritet nga 0.005 ps në 0.02 ps. Pas ekuilibrimit, prodhon 6 µs me një hap kohor prej 0.02 ps. Pas futjes së Emp24, përdorni të njëjtin proces CHARMM GUI për të minimizuar dhe balancuar sistemin, dhe më pas ekzekutojeni për 8 s në prodhim.
Për të gjitha sistemet, gjatë procesit të balancimit, presioni kontrollohet nga barostati Berendsen (59), dhe gjatë procesit të prodhimit, presioni kontrollohet nga barostati Parrinello-Rahman (60). Në të gjitha rastet, presioni mesatar është 1 bar dhe përdoret një skemë çiftëzimi gjysmë-izotropike e presionit. Në procesin e balancimit dhe prodhimit, përdoret një termostat (61) me rikalibrim shpejtësie për të çiftëzuar përkatësisht temperaturën e grimcave të proteinave, lipideve dhe tretësit. Gjatë gjithë operacionit, temperatura e synuar është 310K. Ndërveprimi jo-lidhës llogaritet duke gjeneruar një listë çiftëzimi duke përdorur skemën Verlet me tolerancë tamponi 0.005. Termi Coulomb llogaritet duke përdorur fushën e reagimit dhe një distancë prerëse prej 1.1 nm. Termi Vander Waals përdor një skemë prerëse me një distancë prerëse prej 1.1 nm, dhe skema prerëse Verlet përdoret për zhvendosjen e mundshme (62).
Duke përdorur VMD, gjatësia e valës ndarëse midis sferave të fosfatit DOPC ose sferave të ceramide AM1 dhe proteinës është 0.7 nm, dhe llogaritet numri i lipideve që bashkëveprojnë me proteinën. Sipas formulës së mëposhtme, llogaritni faktorin e varfërimit-pasurimit (DE) si në (63): Faktori DE = (sasia e lipideve totale në proteinë 0.7) në proteinë 0.7 (sasia e Cer në lipidet totale)
Vlera e raportuar merret si mesatare, dhe shiritat e gabimit janë katër kopje të pavarura të SE. Rëndësia statistikore e faktorit DE llogaritet me anë të testit t [(faktori-mesatar DE-1)/SE]. Llogaritni vlerën P nga shpërndarja me një anë.
Mjeti GROMACS u përdor për të llogaritur hartën e dendësisë anësore 2D të sistemit që përmban Emp24 brenda 250 ns të fundit të gjurmës. Për të marrë hartën e pasurimit/zvogëlimit të qeramidit, harta e dendësisë së Cer pjesëtohet me shumën e hartës së Cer dhe DOPC, dhe më pas pjesëtohet me përqendrimin e Cer në trup. Përdoret e njëjta shkallë e hartës së ngjyrave.
Për materiale shtesë për këtë artikull, ju lutemi shihni http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Ky është një artikull me akses të hapur i shpërndarë sipas kushteve të Licencës Creative Commons Attribution-Jo-Commercial, e cila lejon përdorimin, shpërndarjen dhe riprodhimin në çdo medium, për sa kohë që përdorimi përfundimtar nuk është për përfitim komercial dhe kushti kryesor është që vepra origjinale të jetë e saktë. Referencë.
Shënim: Ne ju kërkojmë vetëm të jepni adresën tuaj të email-it në mënyrë që personi që ju rekomandoni në faqe të dijë se ju dëshironi që ai ta shohë email-in dhe se nuk është spam. Ne nuk do të kapim asnjë adresë email-i.
Kjo pyetje përdoret për të testuar nëse jeni vizitor dhe për të parandaluar dërgimin automatik të spam-it.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero-Lopero-Romero-Lopero-Anazion Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Imazheria 3D në kohë reale me rezolucion të lartë zbulon rëndësinë e gjatësisë së zinxhirit të ceramidës për renditjen e proteinave në vendet selektive të daljes.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero-Lopero-Romero-Lopero-Anazion Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Imazheria 3D në kohë reale me rezolucion të lartë zbulon rëndësinë e gjatësisë së zinxhirit të ceramidës për renditjen e proteinave në vendet selektive të daljes.
©2020 Shoqata Amerikane për Avancimin e Shkencës. të gjitha të drejtat e rezervuara. AAAS është partner i HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dhe COUNTER. Shkenca përparon ISSN 2375-2548.