Më parë kemi raportuar se nivelet serike të metabolitit të triptofanit të derivuar nga zorrët, acidit indole-3-propionik (IPA), janë më të ulëta tek pacientët me fibrozë të mëlçisë. Në këtë studim, ne hetuam transkriptomin dhe metilomin e ADN-së në mëlçitë obezë në lidhje me nivelet serike të IPA-së, si dhe rolin e IPA-së në nxitjen e inaktivizimit fenotipik të qelizave yjore hepatike (HSC) in vitro.
Studimi përfshinte 116 pacientë obezë pa diabet mellitus të tipit 2 (T2DM) (mosha 46.8 ± 9.3 vjeç; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m²) të cilët iu nënshtruan kirurgjisë bariatrike në Qendrën e Kirurgjisë Bariatrike Kuopio (KOBS). Nivelet e IPA-së në qarkullim u matën me anë të kromatografisë së lëngshme-spektrometrisë masive (LC-MS), analiza e transkriptomës së mëlçisë u krye me anë të sekuencimit të ARN-së totale dhe analiza e metilimit të ADN-së u krye duke përdorur Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Qelizat yjore hepatike njerëzore (LX-2) u përdorën për eksperimente in vitro.
Nivelet e IPA-së në serum korreluan me shprehjen e gjeneve të përfshira në rrugët apoptotike, mitofagjike dhe të jetëgjatësisë në mëlçi. Gjeni AKT serinë/treoninë kinazë 1 (AKT1) ishte gjeni ndërveprues më i bollshëm dhe dominues në profilet e transkriptit të mëlçisë dhe metilimit të ADN-së. Trajtimi me IPA shkaktoi apoptozë, ulje të frymëmarrjes mitokondriale dhe ndryshim të morfologjisë qelizore dhe dinamikës mitokondriale duke moduluar shprehjen e gjeneve të njohura për rregullimin e fibrozës, apoptozës dhe mbijetesës së qelizave LX-2.
Të marra së bashku, këto të dhëna mbështesin idenë që IPA ka efekte të mundshme terapeutike dhe mund të shkaktojë apoptozë dhe ta zhvendosë fenotipin e HSC drejt një gjendjeje joaktive, duke zgjeruar kështu mundësinë e frenimit të fibrozës së mëlçisë duke ndërhyrë në aktivizimin e HSC dhe metabolizmin mitokondrial.
Prevalenca e obezitetit dhe sindromës metabolike është shoqëruar me një incidencë në rritje të sëmundjes së mëlçisë yndyrore të shoqëruar me metabolizëm (MASLD); sëmundja prek 25% deri në 30% të popullsisë së përgjithshme [1]. Pasoja kryesore e etiologjisë së MASLD është fibroza e mëlçisë, një proces dinamik i karakterizuar nga akumulimi i vazhdueshëm i matricës fibroze jashtëqelizore (ECM) [2]. Qelizat kryesore të përfshira në fibrozën e mëlçisë janë qelizat yjore hepatike (HSC), të cilat shfaqin katër fenotipe të njohura: të qeta, të aktivizuara, të inaktivizuara dhe të plakura [3, 4]. HSC-të mund të aktivizohen dhe të transdiferencohen nga një formë e qetë në qeliza proliferative të ngjashme me fibroblastet me kërkesa të larta energjie, me shprehje të shtuar të α-aktinës së muskujve të lëmuar (α-SMA) dhe kolagjenit të tipit I (Col-I) [5, 6]. Gjatë përmbysjes së fibrozës së mëlçisë, HSC-të e aktivizuara eliminohen nëpërmjet apoptozës ose inaktivizimit. Këto procese përfshijnë uljen e gjeneve fibrogjenike dhe modulimin e gjeneve pro-mbijetesë (siç janë rrugët e sinjalizimit NF-κB dhe PI3K/Akt) [7, 8], si dhe ndryshimet në dinamikën dhe funksionin mitokondrial [9].
Nivelet serike të metabolitit të triptofanit, acidit indole-3-propionik (IPA), të prodhuar në zorrë, janë gjetur të jenë të ulura në sëmundjet metabolike njerëzore, përfshirë MASLD [10-13]. IPA shoqërohet me marrjen e fibrave dietike, është e njohur për efektet e saj antioksiduese dhe anti-inflamatore, dhe dobëson fenotipin e steatohepatitit jo-alkoolik (NASH) të shkaktuar nga dieta in vivo dhe in vitro [11-14]. Disa prova vijnë nga studimi ynë i mëparshëm, i cili tregoi se nivelet serike të IPA ishin më të ulëta tek pacientët me fibrozë të mëlçisë sesa tek pacientët obezë pa fibrozë të mëlçisë në Studimin e Kirurgjisë Bariatrike Kuopio (KOBS). Për më tepër, ne treguam se trajtimi me IPA mund të zvogëlojë shprehjen e gjeneve që janë shënjues klasikë të ngjitjes së qelizave, migrimit të qelizave dhe aktivizimit të qelizave staminale hematopoietike në një model qelizash yjore hepatike njerëzore (LX-2) dhe është një metabolit i mundshëm hepatoprotektiv [15]. Megjithatë, mbetet e paqartë se si IPA shkakton regresionin e fibrozës së mëlçisë duke aktivizuar apoptozën e HSC dhe bioenergjetikën mitokondriale.
Këtu, ne demonstrojmë se IPA në serum është e lidhur me shprehjen e gjeneve të pasuruara në apoptozë, mitofagji dhe rrugë jetëgjatësie në mëlçinë e individëve obezë, por jo me diabet të tipit 2 (KOBS). Për më tepër, ne zbuluam se IPA mund të shkaktojë pastrimin dhe degradimin e qelizave staminale hematopoietike të aktivizuara (HSC) nëpërmjet rrugës së inaktivizimit. Këto rezultate zbulojnë një rol të ri për IPA-në, duke e bërë atë një objektiv të mundshëm terapeutik për të nxitur regresionin e fibrozës së mëlçisë.
Një studim i mëparshëm në kohortën KOBS tregoi se pacientët me fibrozë të mëlçisë kishin nivele më të ulëta të IPA-së në qarkullim krahasuar me pacientët pa fibrozë të mëlçisë [15]. Për të përjashtuar efektin e mundshëm ngatërrues të diabetit të tipit 2, ne rekrutuam 116 pacientë obezë pa diabet të tipit 2 (mosha mesatare ± SD: 46.8 ± 9.3 vjeç; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (Tabela 1) nga studimi në vazhdim KOBS si popullata e studimit [16]. Të gjithë pjesëmarrësit dhanë pëlqimin e informuar me shkrim dhe protokolli i studimit u miratua nga Komiteti i Etikës i Spitalit të Qarkut North Savo në përputhje me Deklaratën e Helsinkit (54/2005, 104/2008 dhe 27/2010).
Mostrat e biopsisë së mëlçisë u morën gjatë kirurgjisë bariatrike dhe u vlerësuan histologjikisht nga patologë me përvojë sipas kritereve të përshkruara më parë [17, 18]. Kriteret e vlerësimit janë përmbledhur në Tabelën Plotësuese S1 dhe janë përshkruar më parë [19].
Mostrat e serumit të esëllit u analizuan me anë të kromatografisë së lëngshme të pashënjestruar-spektrometrisë masive (LC-MS) për analizën metabolomike (n = 116). Mostrat u analizuan duke përdorur një sistem UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Gjermani) siç është përshkruar më parë19. Identifikimi i alkoolit izopropilik (IPA) u bazua në kohën e mbajtjes dhe krahasimin e spektrit MS/MS me standardet e pastra. Intensiteti i sinjalit IPA (zona e kulmit) u konsiderua në të gjitha analizat e mëtejshme [20].
Sekuencimi i ARN-së së të gjithë mëlçisë u krye duke përdorur Illumina HiSeq 2500 dhe të dhënat u përpunuan paraprakisht siç është përshkruar më parë [19, 21, 22]. Ne kryem analizën e shprehjes diferenciale të synuar të transkripteve që ndikojnë në funksionin/biogjenezën mitokondriale duke përdorur 1957 gjene të përzgjedhura nga baza e të dhënave MitoMiner 4.0 [23]. Analiza e metilimit të ADN-së së mëlçisë u krye duke përdorur Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, SHBA) duke përdorur të njëjtën metodologji siç është përshkruar më parë [24, 25].
Qelizat stellate hepatike njerëzore (LX-2) u siguruan me mirësjellje nga Prof. Stefano Romeo dhe u kultivuan e u mbajtën në mjedis DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Për të zgjedhur dozën funksionale të IPA-së, qelizat LX-2 u trajtuan me përqendrime të ndryshme të IPA-së (10 μM, 100 μM dhe 1 mM; Sigma, 220027) në mjedis DMEM/F12 për 24 orë. Për më tepër, për të hetuar aftësinë e IPA-së për të inaktivizuar HSC-të, qelizat LX-2 u trajtuan bashkë me 5 ng/ml TGF-β1 (sistemet R&D, 240-B-002/CF) dhe 1 mM IPA në mjedis pa serum për 24 orë. Për kontrollet përkatëse të mjetit, për trajtimin me TGF-β1 u përdor 4 nM HCL që përmbante 0.1% BSA dhe për trajtimin me IPA u përdor 0.05% DMSO, dhe të dyja u përdorën së bashku për trajtimin e kombinuar.
Apoptoza u vlerësua duke përdorur Kitin e Zbulimit të Apoptozës FITC Annexin V me 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, SHBA, Cat# 640922) sipas udhëzimeve të prodhuesit. Shkurtimisht, LX-2 (1 × 105 qeliza/puset) u kultivuan gjatë natës në pllaka me 12 puseta dhe më pas u trajtuan me doza të shumëfishta të IPA ose IPA dhe TGF-β1. Të nesërmen, qelizat lundruese dhe ngjitëse u mblodhën, u tripsinizuan, u lanë me PBS, u resuspenduan në tamponin lidhës të Annexin V dhe u inkubuan me FITC-Annexin V dhe 7-AAD për 15 minuta.
Mitokondritë në qelizat e gjalla u ngjyrosën për aktivitet oksidativ duke përdorur Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Për analizat MTR, qelizat LX-2 u inkubuan në dendësi të barabarta me IPA dhe TGF-β1. Pas 24 orësh, qelizat e gjalla u tripsinizuan, u lanë me PBS dhe më pas u inkubuan me 100 μM MTR në medium pa serum në 37 °C për 20 minuta siç është përshkruar më parë [26]. Për analizën e morfologjisë së qelizave të gjalla, madhësia e qelizave dhe kompleksiteti citoplazmatik u analizuan duke përdorur përkatësisht parametrat e shpërndarjes përpara (FSC) dhe shpërndarjes anësore (SSC).
Të gjitha të dhënat (30,000 ngjarje) u morën duke përdorur NovoCyte Quanteon (Agilent) dhe u analizuan duke përdorur softuerin NovoExpress® 1.4.1 ose FlowJo V.10.
Shkalla e konsumit të oksigjenit (OCR) dhe shkalla e acidifikimit jashtëqelizor (ECAR) u matën në kohë reale duke përdorur një Analizues të Fluksit Jashtëqelizor Seahorse (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) të pajisur me një Seahorse XF Cell Mito Stress sipas udhëzimeve të prodhuesit. Shkurtimisht, 2 × 104 qeliza LX-2/pus u mbjellën në pllakat e kulturës qelizore XF96. Pas inkubacionit gjatë natës, qelizat u trajtuan me izopropanol (IPA) dhe TGF-β1 (Metodat Plotësuese 1). Analiza e të dhënave u krye duke përdorur softuerin Seahorse XF Wave, i cili përfshin Gjeneratorin e Raportit të Testit të Fenotipit të Energjisë së Qelizave Seahorse XF. Nga kjo, u llogarit një Indeks i Shëndetit Bioenergjetik (BHI) [27].
ARN-ja totale u transkriptua në ADNc. Për metoda specifike, shih referencën [15]. Nivelet e ARNm-së së proteinës acidike ribozomale 60S njerëzore P0 (RPLP0) dhe ciklofilinës A1 (PPIA) u përdorën si kontrolle përbërëse të gjeneve. Sistemi QuantStudio 6 pro Real-Time PCR (Thermo Fisher, Landsmeer, Holandë) u përdor me TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) ose Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050), dhe palosja relative e shprehjes së gjenit u llogarit duke përdorur parametrat krahasues të ciklit të vlerës Ct (ΔΔCt) dhe metodën ΔΔCt. Detajet e prajmerëve janë dhënë në Tabelat Plotësuese S2 dhe S3.
ADN-ja bërthamore (ncADN) dhe ADN-ja mitokondriale (mtADN) u nxorën duke përdorur kitin e gjakut dhe indeve DNeasy (Qiagen) siç është përshkruar më parë [28]. Sasia relative e mtADN-së u llogarit duke llogaritur raportin e secilit rajon të synuar të mtADN-së me mesataren gjeometrike të tre rajoneve të ADN-së bërthamore (mtADN/ncADN), siç detajohet në Metodat Plotësuese 2. Detajet e prajmerëve për mtADN-në dhe ncADN-në jepen në Tabelën Plotësuese S4.
Qelizat e gjalla u ngjyrosën me Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) për të vizualizuar rrjetet mitokondriale ndërqelizore dhe intraqelizore. Qelizat LX-2 (1 × 104 qeliza/pus) u kultivuan në laminat prej qelqi në pllakat përkatëse të kulturës me fund prej qelqi (Ibidi GmbH, Martinsried, Gjermani). Pas 24 orësh, qelizat e gjalla LX-2 u inkubuan me 100 μM MTR për 20 minuta në 37 °C dhe bërthamat e qelizave u ngjyrosën me DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) siç është përshkruar më parë [29]. Rrjetet mitokondriale u vizualizuan duke përdorur një mikroskop të përmbysur Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Gjermani) të pajisur me një modul konfokal Zeiss LSM 800 në 37 °C në një atmosferë të lagësht me 5% CO2 duke përdorur një objektiv 63×NA 1.3. Ne morëm dhjetë imazhe të serisë Z për secilin lloj mostre. Çdo seri Z përmban 30 seksione, secila me një trashësi prej 9.86 μm. Për secilën mostër, imazhe të dhjetë fushave të ndryshme të shikimit u morën duke përdorur programin ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Gjermani), dhe analiza e morfologjisë mitokondriale u krye duke përdorur programin ImageJ (v1.54d) [30, 31] sipas parametrave të detajuar në Metodat Plotësuese 3.
Qelizat u fiksuan me 2% glutaraldehid në tampon fosfati 0.1 M, e ndjekur nga fiksimi me tretësirë ​​1% osmium tetroksid (Sigma Aldrich, MO, SHBA), u dehidratuan gradualisht me aceton (Merck, Darmstadt, Gjermani) dhe në fund u futën në rrëshirë epoksi. Seksionet ultra të holla u përgatitën dhe u ngjyrosën me 1% acetat uranili (Merck, Darmstadt, Gjermani) dhe 1% citrat plumbi (Merck, Darmstadt, Gjermani). Imazhet ultrastrukturale u morën duke përdorur një mikroskop elektronik transmetues JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tokio, Japoni) në një tension përshpejtues prej 80 kV.
Morfologjia e qelizave LX-2 të trajtuara me IPA për 24 orë u analizua me anë të mikroskopisë me kontrast faze në zmadhim 50x duke përdorur një mikroskop me dritë të përmbysur Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 dhe AxioCam MRm, Jena, Gjermani).
Të dhënat klinike u shprehën si mesatare ± devijim standard ose medianë (diapazoni ndërkuartil: IQR). Analiza njëkahëshe e variancës (variablat e vazhdueshme) ose testi χ² (variablat kategorike) u përdorën për të krahasuar ndryshimet midis tre grupeve të studimit. Shkalla e pozitivitetit të rremë (FDR) u përdor për të korrigjuar testimet e shumëfishta, dhe gjenet me FDR < 0.05 u konsideruan statistikisht të rëndësishme. Analiza e korrelacionit Spearman u përdor për të korreluar metilimin e ADN-së CpG me intensitetin e sinjalit IPA, me vlera nominale p (p < 0.05) të raportuara.
Analiza e rrugës u krye duke përdorur një mjet analize të grupit të gjeneve të bazuar në internet (WebGestalt) për 268 transkripte (p nominale < 0.01), 119 transkripte të shoqëruara me mitokondritë (p nominale < 0.05) dhe 4350 CpG nga 3093 transkripte të mëlçisë që ishin të shoqëruara me nivelet e IPA-së në serumin qarkullues. Mjeti Venny DB (versioni 2.1.0) i disponueshëm falas u përdor për të gjetur gjenet që mbivendosen, dhe StringDB (versioni 11.5) u përdor për të vizualizuar ndërveprimet proteinë-proteinë.
Për eksperimentin LX-2, mostrat u testuan për normalitet duke përdorur testin D'Agostino-Pearson. Të dhënat u morën nga të paktën tre replikime biologjike dhe iu nënshtruan ANOVA-s njëkahëshe me testin post hoc Bonferroni. Një vlerë p më pak se 0.05 u konsiderua statistikisht e rëndësishme. Të dhënat paraqiten si mesatare ± SD, dhe numri i eksperimenteve tregohet në secilën figurë. Të gjitha analizat dhe grafikët u kryen duke përdorur programin statistikor GraphPad Prism 8 për Windows (GraphPad Software Inc., versioni 8.4.3, San Diego, SHBA).
Së pari, ne hetuam lidhjen e niveleve të IPA-së në serum me transkriptet e mëlçisë, të të gjithë trupit dhe mitokondriale. Në profilin total të transkriptit, gjeni më i fortë i shoqëruar me nivelet e IPA-së në serum ishte MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; protein kinaza e aktivizuar nga mitogjeni - protein kinaza 3); në profilin e transkriptit të lidhur me mitokondritë, gjeni më i fortë i shoqëruar ishte AKT1 (FDR = 0.7621; AKT serinë/treoninë kinaza 1) (Dosja shtesë 1 dhe Dosja shtesë 2).
Pastaj analizuam transkriptet globale (n = 268; p < 0.01) dhe transkriptet e shoqëruara me mitokondritë (n = 119; p < 0.05), duke identifikuar në fund apoptozën si rrugën kanonike më të rëndësishme (p = 0.0089). Për transkriptet mitokondriale të shoqëruara me nivelet e IPA-së në serum, ne u përqendruam në apoptozë (FDR = 0.00001), mitofagji (FDR = 0.00029) dhe rrugët e sinjalizimit TNF (FDR = 0.000006) (Figura 1A, Tabela 2 dhe Figurat Plotësuese 1A-B).
Analiza mbivendosëse e transkripteve globale të shoqëruara me mitokondritë dhe metilimit të ADN-së në mëlçinë e njeriut në lidhje me nivelet e IPA-së në serum. A përfaqëson 268 transkripte globale, 119 transkripte të shoqëruara me mitokondritë dhe transkripte të metiluara të ADN-së që janë të hartuara në 3092 vende CpG të shoqëruara me nivelet e IPA-së në serum (vlerat p < 0.01 për transkriptet globale dhe ADN-në e metiluar, dhe vlerat p < 0.05 për transkriptet mitokondriale). Transkriptet kryesore të mbivendosura tregohen në mes (AKT1 dhe YKT6). B Harta e ndërveprimit të 13 gjeneve me rezultatin më të lartë të ndërveprimit (0.900) me gjenet e tjera u ndërtua nga 56 gjenet mbivendosëse (rajoni i vijës së zezë) që ishin të lidhura në mënyrë të konsiderueshme me nivelet e IPA-së në serum duke përdorur mjetin online StringDB. E gjelbër: Gjenet e hartuara në komponentin qelizor të Ontologjisë së Gjeneve (GO): mitokondritë (GO:0005739). AKT1 është proteina me rezultatin më të lartë (0.900) për ndërveprimet me proteina të tjera bazuar në të dhëna (bazuar në nxjerrjen e tekstit, eksperimente, baza të dhënash dhe bashkë-shprehje). Nyjet e rrjetit përfaqësojnë proteinat, dhe skajet përfaqësojnë lidhjet midis proteinave.
Meqenëse metabolitët e mikrobiotës së zorrëve mund të rregullojnë përbërjen epigjenetike përmes metilimit të ADN-së [32], ne hetuam nëse nivelet e IPA-së në serum ishin të lidhura me metilimin e ADN-së në mëlçi. Ne zbuluam se dy vendet kryesore të metilimit të lidhura me nivelet e IPA-së në serum ishin pranë rajonit 3 të pasur me prolinë-serinë (C19orf55) dhe anëtarit 6 të familjes së proteinave të shokut nga nxehtësia B (i vogël) (HSPB6) (Dosja shtesë 3). Metilimi i ADN-së së 4350 CpG (p < 0.01) ishte i korreluar me nivelet e IPA-së në serum dhe ishte i pasuruar në shtigje rregullatore të jetëgjatësisë (p = 0.006) (Figura 1A, Tabela 2 dhe Figura plotësuese 1C).
Për të kuptuar mekanizmat biologjikë që qëndrojnë në themel të lidhjeve midis niveleve të IPA-së në serum, transkripteve globale, transkripteve të shoqëruara me mitokondritë dhe metilimit të ADN-së në mëlçinë e njeriut, ne kryem një analizë mbivendosjeje të gjeneve të identifikuara në analizën e mëparshme të rrugës (Figura 1A). Rezultatet e analizës së pasurimit të rrugës së 56 gjeneve mbivendosëse (brenda vijës së zezë në Figurën 1A) treguan se rruga e apoptozës (p = 0.00029) nxori në pah dy gjene të përbashkëta për të tre analizat: AKT1 dhe YKT6 (homologu YKT6 v-SNARE), siç tregohet në diagramin Venn (Figura plotësuese 2 dhe Figura 1A). Është interesante se zbuluam se AKT1 (cg19831386) dhe YKT6 (cg24161647) ishin të lidhura pozitivisht me nivelet e IPA-së në serum (Dosja shtesë 3). Për të identifikuar ndërveprimet e mundshme të proteinave midis produkteve të gjeneve, ne zgjodhëm 13 gjene me rezultatin më të lartë të rajonit të përbashkët (0.900) midis 56 gjeneve mbivendosëse si të dhëna hyrëse dhe ndërtuam një hartë ndërveprimi. Sipas nivelit të besimit (besimi marxhinal), gjeni AKT1 me rezultatin më të lartë (0.900) ishte në krye (Figura 1B).
Bazuar në analizën e rrugës, zbuluam se apoptoza ishte rruga kryesore, kështu që hetuam nëse trajtimi me IPA do të ndikonte në apoptozën e qelizave HSC in vitro. Më parë kemi demonstruar se doza të ndryshme të IPA-së (10 μM, 100 μM dhe 1 mM) ishin jotoksike për qelizat LX-2 [15]. Ky studim tregoi se trajtimi me IPA në 10 μM dhe 100 μM rriti numrin e qelizave të qëndrueshme dhe nekrotike. Megjithatë, krahasuar me grupin e kontrollit, qëndrueshmëria e qelizave u ul në përqendrimin 1 mM të IPA-së, ndërsa shkalla e nekrozës së qelizave mbeti e pandryshuar (Figura 2A, B). Më pas, për të gjetur përqendrimin optimal për të nxitur apoptozën në qelizat LX-2, testuam 10 μM, 100 μM dhe 1 mM IPA për 24 orë (Figura 2A-E dhe Figura plotësuese 3A-B). Është interesante që IPA 10 μM dhe 100 μM uli shkallën e apoptozës (%), megjithatë, IPA 1 mM rriti apoptozën e vonë dhe shkallën e apoptozës (%) krahasuar me kontrollin dhe për këtë arsye u zgjodh për eksperimente të mëtejshme (Figurat 2A–D).
IPA shkakton apoptozën e qelizave LX-2. Metoda e ngjyrosjes së dyfishtë me Annexin V dhe 7-AAD u përdor për të përcaktuar shkallën apoptotike dhe morfologjinë e qelizave me anë të citometrisë me rrjedhë. Qelizat BA u inkubuan me 10 μM, 100 μM dhe 1 mM IPA për 24 orë ose me F–H TGF-β1 (5 ng/ml) dhe 1 mM IPA në mjedis pa serum për 24 orë. A: qeliza të gjalla (Anexin V -/ 7AAD-); B: qeliza nekrotike (Anexin V -/ 7AAD+); C, F: qeliza të hershme (Anexin V +/ 7AAD-); D, G: qeliza të vona (Anexin V+/7AAD.+); E, H: përqindja e qelizave totale apoptotike të hershme dhe të vona në shkallën apoptotike (%). Të dhënat shprehen si mesatare ± SD, n = 3 eksperimente të pavarura. Krahasimet statistikore u kryen duke përdorur ANOVA me një drejtim me testin post hoc Bonferroni. *p < 0.05; ****p < 0.0001
Siç e kemi treguar më parë, 5 ng/ml TGF-β1 mund të shkaktojë aktivizimin e HSC duke rritur shprehjen e gjeneve shënuese klasike [15]. Qelizat LX-2 u trajtuan me 5 ng/ml TGF-β1 dhe 1 mM IPA në kombinim (Fig. 2E–H). Trajtimi me TGF-β1 nuk e ndryshoi shkallën e apoptozës, megjithatë, bashkë-trajtimi me IPA rriti apoptozën e vonë dhe shkallën e apoptozës (%) krahasuar me trajtimin me TGF-β1 (Fig. 2E–H). Këto rezultate tregojnë se 1 mM IPA mund të nxisë apoptozën në qelizat LX-2 në mënyrë të pavarur nga induksioni i TGF-β1.
Ne hetuam më tej efektin e IPA-së në frymëmarrjen mitokondriale në qelizat LX-2. Rezultatet treguan se 1 mM IPA uli parametrat e shkallës së konsumit të oksigjenit (OCR): frymëmarrjen jo-mitokondriale, frymëmarrjen bazale dhe maksimale, rrjedhjen e protoneve dhe prodhimin e ATP-së krahasuar me grupin e kontrollit (Figura 3A, B), ndërsa indeksi i shëndetit bioenergjik (BHI) nuk ndryshoi.
IPA zvogëlon frymëmarrjen mitokondriale në qelizat LX-2. Kurba e frymëmarrjes mitokondriale (OCR) paraqitet si parametra të frymëmarrjes mitokondriale (frymëmarrja jo-mitokondriale, frymëmarrja bazale, frymëmarrja maksimale, rrjedhja e protoneve, gjenerimi i ATP-së, SRC dhe BHI). Qelizat A dhe B u inkubuan me 10 μM, 100 μM dhe 1 mM IPA për 24 orë, përkatësisht. Qelizat C dhe D u inkubuan me TGF-β1 (5 ng/ml) dhe 1 mM IPA në mjedis pa serum për 24 orë, përkatësisht. Të gjitha matjet u normalizuan në përmbajtjen e ADN-së duke përdorur kitin CyQuant. BHI: indeksi i shëndetit bioenergjik; SRC: kapaciteti rezervë i frymëmarrjes; OCR: shkalla e konsumit të oksigjenit. Të dhënat paraqiten si mesatare ± devijim standard (SD), n = 5 eksperimente të pavarura. Krahasimet statistikore u kryen duke përdorur ANOVA me një drejtim dhe testin Bonferroni post hoc. *p < 0.05; **p < 0.01; dhe ***p < 0.001
Për të fituar një kuptim më gjithëpërfshirës të efektit të IPA-së në profilin bioenergetik të qelizave LX-2 të aktivizuara nga TGF-β1, ne analizuam fosforilimin oksidativ mitokondrial me anë të OCR (Fig. 3C, D). Rezultatet treguan se trajtimi me TGF-β1 mund të zvogëlonte frymëmarrjen maksimale, kapacitetin rezervë të frymëmarrjes (SRC) dhe BHI krahasuar me grupin e kontrollit (Fig. 3C, D). Përveç kësaj, trajtimi i kombinuar uli frymëmarrjen bazale, rrjedhjen e protoneve dhe prodhimin e ATP-së, por SRC dhe BHI ishin dukshëm më të larta se ato të trajtuara me TGF-β1 (Fig. 3C, D).
Ne gjithashtu kryem "Testin e Fenotipit të Energjisë Qelizore" të ofruar nga softueri Seahorse (Fig. Plotësuese 4A–D). Siç tregohet në Fig. Plotësuese 3B, potencialet metabolike të OCR dhe ECAR u ulën pas trajtimit me TGF-β1, megjithatë, nuk u vu re asnjë ndryshim në grupet e trajtimit me kombinim dhe IPA krahasuar me grupin e kontrollit. Për më tepër, nivelet bazale dhe të stresit të OCR u ulën pas trajtimit me kombinim dhe IPA krahasuar me grupin e kontrollit (Fig. Plotësuese 4C). Është interesante se një model i ngjashëm u vu re me terapinë e kombinuar, ku nuk u vu re asnjë ndryshim në nivelet bazale dhe të stresit të ECAR krahasuar me trajtimin me TGF-β1 (Fig. Plotësuese 4C). Në HSC, zvogëlimi i fosforilimit oksidativ mitokondrial dhe aftësia e trajtimit të kombinuar për të rivendosur SCR dhe BHI pas ekspozimit ndaj trajtimit me TGF-β1 nuk e ndryshuan potencialin metabolik (OCR dhe ECAR). Të marra së bashku, këto rezultate tregojnë se IPA mund të zvogëlojë bioenergjetikën në HSC, duke sugjeruar që IPA mund të shkaktojë një profil energjik më të ulët që e zhvendos fenotipin e HSC drejt inaktivizimit (Figura plotësuese 4D).
Efekti i IPA-së në dinamikën mitokondriale u hetua duke përdorur kuantifikimin tre-dimensional të morfologjisë mitokondriale dhe lidhjeve të rrjetit, si dhe ngjyrosjen MTR (Figura 4 dhe Figura plotësuese 5). Figura 4 tregon se, krahasuar me grupin e kontrollit, trajtimi me TGF-β1 uli sipërfaqen mesatare, numrin e degëve, gjatësinë totale të degëve dhe numrin e kryqëzimit të degëve (Figura 4A dhe B) dhe ndryshoi përqindjen e mitokondrive nga morfologjia sferike në atë të ndërmjetme (Figura 4C). Vetëm trajtimi me IPA uli vëllimin mesatar mitokondrial dhe ndryshoi përqindjen e mitokondrive nga morfologjia sferike në atë të ndërmjetme krahasuar me grupin e kontrollit (Figura 4A). Në të kundërt, sfericiteti, gjatësia mesatare e degës dhe aktiviteti mitokondrial i vlerësuar nga MTR i varur nga potenciali i membranës mitokondriale (Figura 4A dhe E) mbetën të pandryshuara dhe këto parametra nuk ndryshuan midis grupeve. Të marra së bashku, këto rezultate sugjerojnë që trajtimi me TGF-β1 dhe IPA duket se modulojnë formën dhe madhësinë mitokondriale, si dhe kompleksitetin e rrjetit në qelizat e gjalla LX-2.
IPA ndryshon dinamikën mitokondriale dhe bollëkun e ADN-së mitokondriale në qelizat LX-2. A. Imazhe konfokale përfaqësuese të qelizave të gjalla LX-2 të inkubuara me TGF-β1 (5 ng/ml) dhe 1 mM IPA për 24 orë në mjedis pa serum që tregojnë rrjete mitokondriale të ngjyrosura me Mitotracker™ Red CMXRos dhe bërthama të ngjyrosura blu me DAPI. Të gjitha të dhënat përmbanin të paktën 15 imazhe për grup. Ne morëm 10 imazhe Z-stack për secilin lloj mostre. Çdo sekuencë e boshtit Z përmbante 30 feta, secila me një trashësi prej 9.86 μm. Shiriti i shkallës: 10 μm. B. Objekte përfaqësuese (vetëm mitokondrie) të identifikuara duke aplikuar pragun adaptiv në imazh. Analiza sasiore dhe krahasimi i lidhjeve të rrjetit morfologjik mitokondrial u kryen për të gjitha qelizat në secilin grup. C. Frekuenca e raporteve të formës mitokondriale. Vlerat afër 0 tregojnë forma sferike, dhe vlerat afër 1 tregojnë forma filamentoze. D Përmbajtja e ADN-së mitokondriale (mtADN) u përcaktua siç përshkruhet në Materialet dhe Metodat. E Analiza e Mitotracker™ Red CMXRos u krye me anë të citometrisë me rrjedhë (30,000 ngjarje) siç përshkruhet në Materialet dhe Metodat. Të dhënat paraqiten si mesatare ± SD, n = 3 eksperimente të pavarura. Krahasimet statistikore u kryen duke përdorur ANOVA me një drejtim dhe testin Bonferroni post hoc. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Pastaj analizuam përmbajtjen e mtADN-së në qelizat LX-2 si një tregues të numrit mitokondrial. Krahasuar me grupin e kontrollit, përmbajtja e mtADN-së u rrit në grupin e trajtuar me TGF-β1 (Figura 4D). Krahasuar me grupin e trajtuar me TGF-β1, përmbajtja e mtADN-së u ul në grupin e trajtimit të kombinuar (Figura 4D), duke sugjeruar që IPA mund të zvogëlojë përmbajtjen e mtADN-së dhe ndoshta numrin mitokondrial, si dhe frymëmarrjen mitokondriale (Figura 3C). Për më tepër, IPA dukej se zvogëlonte përmbajtjen e mtADN-së në trajtimin e kombinuar, por nuk ndikoi në aktivitetin mitokondrial të ndërmjetësuar nga MTR (Figurat 4A–C).
Ne hetuam lidhjen e IPA-s me nivelet e ARNi-së së gjeneve të shoqëruara me fibrozën, apoptozën, mbijetesën dhe dinamikën mitokondriale në qelizat LX-2 (Figura 5A–D). Krahasuar me grupin e kontrollit, grupi i trajtuar me TGF-β1 tregoi shprehje të shtuar të gjeneve të tilla si zinxhiri α2 i kolagjenit tip I (COL1A2), aktina e muskujve të lëmuar α (αSMA), metaloproteinaza 2 e matricës (MMP2), frenuesi i indeve të metaloproteinazës 1 (TIMP1) dhe gjeni i ngjashëm me dinaminën 1 (DRP1), duke treguar rritje të fibrozës dhe aktivizimit. Për më tepër, krahasuar me grupin e kontrollit, trajtimi me TGF-β1 uli nivelet e ARNi-së të receptorit bërthamor të pregnanit X (PXR), kaspazës 8 (CASP8), MAPKAPK3, frenuesit të qelizave B α, përforcuesit të peptidit të lehtë të gjenit të faktorit bërthamor κ (NFκB1A) dhe frenuesit të nënnjësisë β të kinazës së faktorit bërthamor κB (IKBKB) (Figura 5A–D). Krahasuar me trajtimin me TGF-β1, trajtimi i kombinuar me TGF-β1 dhe IPA uli shprehjen e COL1A2 dhe MMP2, por rriti nivelet e mRNA-së të PXR, TIMP1, limfomës së qelizave B-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β dhe IKBKB. Trajtimi me IPA uli ndjeshëm shprehjen e MMP2, proteinës X të shoqëruar me Bcl-2 (BAX), AKT1, proteinës 1 të atrofisë optike (OPA1) dhe proteinës 2 të bashkimit mitokondrial (MFN2), ndërsa shprehja e CASP8, NFκB1A, NFκB1B dhe IKBKB u rrit krahasuar me grupin e kontrollit. Megjithatë, nuk u gjet asnjë ndryshim në shprehjen e caspase-3 (CASP3), faktorit 1 të aktivizimit të peptidazës apoptotike (APAF1), proteinës 1 të bashkimit mitokondrial (MFN1) dhe proteinës 1 të ndarjes (FIS1). Së bashku, këto rezultate sugjerojnë që trajtimi me IPA modulon shprehjen e gjeneve të shoqëruara me fibrozën, apoptozën, mbijetesën dhe dinamikën mitokondriale. Të dhënat tona sugjerojnë që trajtimi me IPA zvogëlon fibrozën në qelizat LX-2; në të njëjtën kohë, ai stimulon mbijetesën duke e zhvendosur fenotipin drejt inaktivizimit.
IPA modulon shprehjen e gjeneve të fibroblasteve, apoptozës, qëndrueshmërisë dhe dinamikës mitokondriale në qelizat LX-2. Histogramet shfaqin shprehjen e mRNA-së në lidhje me kontrollin endogjen (RPLP0 ose PPIA) pasi qelizat LX-2 u induktuan me TGF-β1 dhe IPA në mjedis pa serum për 24 orë. A tregon fibroblaste, B tregon qeliza apoptotike, C tregon qelizat mbijetuese dhe D tregon shprehjen e gjenit të dinamikës mitokondriale. Të dhënat paraqiten si mesatare ± devijim standard (SD), n = 3 eksperimente të pavarura. Krahasimet statistikore u kryen duke përdorur ANOVA me një drejtim dhe testin Bonferroni post hoc. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Pastaj, ndryshimet në madhësinë e qelizave (FSC-H) dhe kompleksiteti citoplazmatik (SSC-H) u vlerësuan me anë të citometrisë me rrjedhë (Figura 6A,B), dhe ndryshimet në morfologjinë e qelizave pas trajtimit me IPA u vlerësuan me anë të mikroskopisë elektronike të transmetimit (TEM) dhe mikroskopisë me kontrast faze (Figura plotësuese 6A-B). Siç pritej, qelizat në grupin e trajtuar me TGF-β1 u rritën në madhësi krahasuar me grupin e kontrollit (Figura 6A,B), duke treguar zgjerimin klasik të retikulumit të ashpër endoplazmatik (ER*) dhe fagolizozomeve (P), duke treguar aktivizimin e qelizave staminale hematopoietike (HSC) (Figura plotësuese 6A). Megjithatë, krahasuar me grupin e trajtuar me TGF-β1, madhësia e qelizave, kompleksiteti citoplazmatik (Fig. 6A,B) dhe përmbajtja e ER* u ulën në grupin e trajtimit të kombinuar TGF-β1 dhe IPA (Fig. plotësuese 6A). Për më tepër, trajtimi me IPA uli madhësinë e qelizave, kompleksitetin citoplazmatik (Fig. 6A, B), përmbajtjen e P dhe ER* (Fig. Plotësuese 6A) krahasuar me grupin e kontrollit. Përveç kësaj, përmbajtja e qelizave apoptotike u rrit pas 24 orësh trajtimi me IPA krahasuar me grupin e kontrollit (shigjetat e bardha, Fig. Plotësuese 6B). Së bashku, këto rezultate sugjerojnë që 1 mM IPA mund të stimulojë apoptozën e HSC dhe të përmbysë ndryshimet në parametrat morfologjikë të qelizave të shkaktuara nga TGF-β1, duke rregulluar kështu madhësinë dhe kompleksitetin e qelizave, të cilat mund të shoqërohen me inaktivizimin e HSC.
IPA ndryshon madhësinë e qelizave dhe kompleksitetin citoplazmatik në qelizat LX-2. Imazhe përfaqësuese të analizës së citometrisë me rrjedhje. Analiza përdori një strategji hapëse specifike për qelizat LX-2: SSC-A/FSC-A për të përcaktuar popullatën qelizore, FSC-H/FSC-A për të identifikuar dubletet dhe SSC-H/FSC-H për analizën e madhësisë dhe kompleksitetit të qelizave. Qelizat u inkubuan me TGF-β1 (5 ng/ml) dhe 1 mM IPA në mjedis pa serum për 24 orë. Qelizat LX-2 u shpërndanë në kuadrantin e poshtëm të majtë (SSC-H-/FSC-H-), kuadrantin e sipërm të majtë (SSC-H+/FSC-H-), kuadrantin e poshtëm të djathtë (SSC-H-/FSC-H+) dhe kuadrantin e sipërm të djathtë (SSC-H+/FSC-H+) për analizën e madhësisë së qelizave dhe kompleksitetit citoplazmatik. B. Morfologjia qelizore u analizua me anë të citometrisë me rrjedhë duke përdorur FSC-H (shpërndarje përpara, madhësia e qelizës) dhe SSC-H (shpërndarje anësore, kompleksitet citoplazmatik) (30,000 ngjarje). Të dhënat paraqiten si mesatare ± SD, n = 3 eksperimente të pavarura. Krahasimet statistikore u kryen duke përdorur ANOVA me një drejtim dhe testin Bonferroni post hoc. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 dhe ****p < 0.0001
Metabolitët e zorrëve si IPA janë bërë një temë e nxehtë kërkimore, duke sugjeruar se objektiva të rinj mund të zbulohen në mikrobiotën e zorrëve. Prandaj është interesante që IPA, një metabolit që ne e kemi lidhur me fibrozën e mëlçisë tek njerëzit [15], është treguar të jetë një përbërës potencial antifibrotik në modelet shtazore [13, 14]. Këtu, ne demonstrojmë për herë të parë një lidhje midis IPA-së në serum dhe transkriptomikës globale të mëlçisë dhe metilimit të ADN-së tek individët obezë pa diabet të tipit 2 (T2D), duke theksuar apoptozën, mitofagjinë dhe jetëgjatësinë, si dhe një gjen të mundshëm kandidat AKT1 që rregullon homeostazën e mëlçisë. Një risi tjetër e studimit tonë është se ne demonstruam ndërveprimin e trajtimit me IPA me apoptozën, morfologjinë qelizore, bioenergjetikën mitokondriale dhe dinamikën në qelizat LX-2, duke treguar një spektër më të ulët energjie që zhvendos fenotipin HSC drejt inaktivizimit, duke e bërë IPA-në një kandidat potencial për përmirësimin e fibrozës së mëlçisë.
Ne zbuluam se apoptoza, mitofagjia dhe jetëgjatësia ishin rrugët kanonike më të rëndësishme të pasuruara në gjenet e mëlçisë të shoqëruara me IPA-në në serumin qarkullues. Ndërprerja e sistemit të kontrollit të cilësisë mitokondriale (MQC) mund të çojë në mosfunksionim mitokondrial, mitofaginë dhe apoptozën, duke nxitur kështu shfaqjen e MASLD [33, 34]. Prandaj, mund të spekulojmë se IPA mund të jetë e përfshirë në ruajtjen e dinamikës qelizore dhe integritetit mitokondrial përmes apoptozës, mitofagjisë dhe jetëgjatësisë në mëlçi. Të dhënat tona treguan se dy gjene ishin të përbashkëta në të tre analizat: YKT6 dhe AKT1. Vlen të përmendet se YKT6 është një proteinë SNARE e përfshirë në procesin e bashkimit të membranës qelizore. Ajo luan një rol në autofagji dhe mitofaginë duke formuar një kompleks inicimi me STX17 dhe SNAP29 në autofagozomë, duke nxitur kështu bashkimin e autofagosomeve dhe lizosomeve [35]. Për më tepër, humbja e funksionit YKT6 rezulton në mitofaginë e dëmtuar[36], ndërsa rritja e YKT6 shoqërohet me përparimin e karcinomës hepatoqelizore (HCC), duke treguar mbijetesë të rritur të qelizave[37]. Nga ana tjetër, AKT1 është gjeni më i rëndësishëm ndërveprues dhe luan një rol të rëndësishëm në sëmundjet e mëlçisë, duke përfshirë rrugën e sinjalizimit PI3K/AKT, ciklin qelizor, migrimin e qelizave, përhapjen, ngjitjen fokale, funksionin mitokondrial dhe sekretimin e kolagjenit[38-40]. Rruga e aktivizuar e sinjalizimit PI3K/AKT mund të aktivizojë qelizat staminale hematopoietike (HSC), të cilat janë qelizat përgjegjëse për prodhimin e matricës jashtëqelizore (ECM), dhe çrregullimi i saj mund të kontribuojë në shfaqjen dhe përparimin e fibrozës së mëlçisë[40]. Përveç kësaj, AKT është një nga faktorët kryesorë të mbijetesës së qelizave që pengon apoptozën e qelizave të varura nga p53, dhe aktivizimi i AKT mund të shoqërohet me frenimin e apoptozës së qelizave të mëlçisë[41, 42]. Rezultatet e përftuara sugjerojnë që IPA mund të jetë e përfshirë në apoptozën e lidhur me mitokondritë e mëlçisë duke ndikuar në vendimin e hepatociteve midis hyrjes në apoptozë dhe mbijetesës. Këto efekte mund të rregullohen nga gjenet kandidate AKT dhe/ose YKT6, të cilat janë kritike për homeostazën e mëlçisë.
Rezultatet tona treguan se 1 mM IPA shkaktoi apoptozë dhe uli frymëmarrjen mitokondriale në qelizat LX-2 pavarësisht nga trajtimi me TGF-β1. Vlen të përmendet se apoptoza është një rrugë kryesore për zgjidhjen e fibrozës dhe aktivizimin e qelizave staminale hematopoietike (HSC), dhe është gjithashtu një ngjarje kyçe në përgjigjen fiziologjike të kthyeshme të fibrozës së mëlçisë [4, 43]. Për më tepër, rivendosja e BHI në qelizat LX-2 pas trajtimit të kombinuar ofroi njohuri të reja mbi rolin potencial të IPA në rregullimin e bioenergjetikës mitokondriale. Në kushte pushimi dhe joaktive, qelizat hematopoietike normalisht përdorin fosforilimin oksidativ mitokondrial për të prodhuar ATP dhe kanë aktivitet të ulët metabolik. Nga ana tjetër, aktivizimi i HSC rrit frymëmarrjen mitokondriale dhe biosintezën për të kompensuar kërkesat e energjisë për hyrjen në gjendjen glikolitike [44]. Fakti që IPA nuk ndikoi në potencialin metabolik dhe ECAR sugjeron që rruga glikolitike është më pak e prioritizuar. Në mënyrë të ngjashme, një studim tjetër tregoi se 1 mM IPA ishte në gjendje të modulonte aktivitetin e zinxhirit respirator mitokondrial në kardiomiocite, linjën qelizore të hepatociteve njerëzore (Huh7) dhe qelizat endoteliale të venës umbilikale njerëzore (HUVEC); Megjithatë, nuk u gjet asnjë efekt i IPA në glikolizë në kardiomiocite, duke sugjeruar që IPA mund të ndikojë në bioenergjetikën e llojeve të tjera të qelizave [45]. Prandaj, ne spekulojmë se 1 mM IPA mund të veprojë si një shkëputës kimik i butë, pasi mund të zvogëlojë ndjeshëm shprehjen e gjenit fibrogjenik, morfologjinë qelizore dhe bioenergjetikën mitokondriale pa ndryshuar sasinë e mtADN-së [46]. Shkëputësit mitokondrialë mund të pengojnë fibrozën e induktuar nga kultura dhe aktivizimin e HSC [47] dhe të zvogëlojnë prodhimin mitokondrial të ATP të rregulluar ose të induktuar nga proteina të caktuara siç janë proteinat shkëputëse (UCP) ose translokaza e nukleotidit të adeninës (ANT). Në varësi të llojit të qelizës, ky fenomen mund të mbrojë qelizat nga apoptoza dhe/ose të nxisë apoptozën [46]. Megjithatë, nevojiten studime të mëtejshme për të sqaruar rolin e IPA-së si një shkëputës mitokondrial në inaktivizimin e qelizave staminale hematopoietike.
Pastaj ne hetuam nëse ndryshimet në frymëmarrjen mitokondriale reflektohen në morfologjinë mitokondriale në qelizat e gjalla LX-2. Është interesante se trajtimi me TGF-β1 ndryshon proporcionin mitokondrial nga sferik në të ndërmjetëm, me ulje të degëzimit mitokondrial dhe rritje të shprehjes së DRP1, një faktor kyç në ndarjen mitokondriale [48]. Për më tepër, fragmentimi mitokondrial shoqërohet me kompleksitetin e përgjithshëm të rrjetit, dhe kalimi nga bashkimi në ndarje është kritik për aktivizimin e qelizave staminale hematopoietike (HSC), ndërsa frenimi i ndarjes mitokondriale çon në apoptozë të HSC [49]. Kështu, rezultatet tona tregojnë se trajtimi me TGF-β1 mund të shkaktojë një ulje të kompleksitetit të rrjetit mitokondrial me ulje të degëzimit, i cili është më i zakonshëm në ndarjen mitokondriale të shoqëruar me qelizat staminale hematopoietike të aktivizuara (HSC). Për më tepër, të dhënat tona treguan se IPA mund të ndryshojë proporcionin e mitokondrive nga forma sferike në të ndërmjetme, duke zvogëluar kështu shprehjen e OPA1 dhe MFN2. Studimet kanë treguar se ulja e OPA1 mund të shkaktojë një ulje të potencialit të membranës mitokondriale dhe të shkaktojë apoptozë qelizore [50]. MFN2 njihet si ndërmjetësues i bashkimit mitokondrial dhe apoptozës [51]. Rezultatet e përftuara sugjerojnë që induksioni i qelizave LX-2 nga TGF-β1 dhe/ose IPA duket se modulon formën dhe madhësinë mitokondriale, si dhe gjendjen e aktivizimit dhe kompleksitetin e rrjetit.
Rezultatet tona tregojnë se trajtimi i kombinuar i TGFβ-1 dhe IPA mund të zvogëlojë mtADN-në dhe parametrat morfologjikë të qelizave duke rregulluar shprehjen e mRNA-së të fibrozës, apoptozës dhe gjeneve të lidhura me mbijetesën në qelizat që shmangin apoptozën. Në të vërtetë, IPA uli nivelin e shprehjes së mRNA-së të AKT1 dhe gjeneve të rëndësishme të fibrozës si COL1A2 dhe MMP2, por rriti nivelin e shprehjes së CASP8, i cili shoqërohet me apoptozën. Rezultatet tona treguan se pas trajtimit me IPA, shprehja e BAX u ul dhe shprehja e mRNA-së e nënnjësive të familjes TIMP1, BCL-2 dhe NF-κB u rrit, duke sugjeruar që IPA mund të stimulojë sinjalet e mbijetesës në qelizat staminale hematopoietike (HSC) që shmangin apoptozën. Këto molekula mund të veprojnë si sinjale pro-mbijetese në qelizat staminale hematopoietike të aktivizuara, të cilat mund të shoqërohen me rritjen e shprehjes së proteinave anti-apoptotike (të tilla si Bcl-2), uljen e shprehjes së BAX pro-apoptotike dhe një ndërveprim kompleks midis TIMP dhe NF-κB [5, 7]. IPA ushtron efektet e saj përmes PXR, dhe ne zbuluam se trajtimi i kombinuar me TGF-β1 dhe IPA rriti nivelet e shprehjes së mRNA-së së PXR, duke treguar shtypjen e aktivizimit të HSC. Sinjalizimi i aktivizuar i PXR dihet se pengon aktivizimin e HSC si in vivo ashtu edhe in vitro [52, 53]. Rezultatet tona tregojnë se IPA mund të marrë pjesë në pastrimin e HSC-ve të aktivizuara duke nxitur apoptozën, duke zvogëluar fibrozën dhe metabolizmin mitokondrial, dhe duke rritur sinjalet e mbijetesës, të cilat janë procese tipike që e shndërrojnë fenotipin e aktivizuar të HSC në një të çaktivizuar. Një shpjegim tjetër i mundshëm për mekanizmin dhe rolin e mundshëm të IPA në apoptozë është se ajo pastron mitokondritë jofunksionale kryesisht përmes mitofagjisë (rruga e brendshme) dhe rrugës së sinjalizimit të jashtëm TNF (Tabela 1), e cila është e lidhur drejtpërdrejt me rrugën e sinjalizimit të mbijetesës NF-κB (Figura Plotësuese 7). Është interesante se gjenet e pasuruara të lidhura me IPA janë në gjendje të nxisin sinjale pro-apoptotike dhe pro-mbijetese në rrugën apoptotike [54], duke sugjeruar që IPA mund të nxisë rrugën apoptotike ose mbijetesën duke bashkëvepruar me këto gjene. Megjithatë, mënyra se si IPA shkakton apoptozën ose mbijetesën gjatë aktivizimit të HSC dhe rrugët e saj mekanistike mbetet e paqartë.
IPA është një metabolit mikrobik i formuar nga triptofani dietik nëpërmjet mikrobiotës së zorrëve. Studimet kanë treguar se ai ka veti rregullatore anti-inflamatore, antioksiduese dhe epigjenetike në mjedisin e zorrëve.[55] Studimet kanë treguar se IPA mund të modulojë funksionin e barrierës së zorrëve dhe të zvogëlojë stresin oksidativ, gjë që mund të kontribuojë në efektet e tij fiziologjike lokale.[56] Në fakt, IPA transportohet në organet e synuara nëpërmjet qarkullimit të gjakut, dhe meqenëse IPA ndan një strukturë të ngjashme metabolite kryesore me triptofanin, serotoninën dhe derivatet e indolit, IPA ushtron veprime metabolike që rezultojnë në fate metabolike konkurruese.[52] IPA mund të konkurrojë me metabolitët e derivuar nga triptofani për vendet e lidhjes në enzima ose receptorë, duke prishur potencialisht rrugët normale metabolike. Kjo thekson nevojën për studime të mëtejshme mbi farmakokinetikën dhe farmakodinamikën e tij për të kuptuar më mirë dritaren e tij terapeutike.[57] Mbetet për t'u parë nëse kjo mund të ndodhë edhe në qelizat staminale hematopoietike (HSC).
Ne pranojmë që studimi ynë ka disa kufizime. Për të shqyrtuar në mënyrë specifike shoqërimet që lidhen me IPA-në, përjashtuam pacientët me diabet mellitus tip 2 (T2DM). Ne pranojmë që kjo kufizon zbatueshmërinë e gjerë të gjetjeve tona tek pacientët me diabet mellitus tip 2 dhe sëmundje të avancuar të mëlçisë. Edhe pse përqendrimi fiziologjik i IPA-së në serumin e njeriut është 1-10 μM [11, 20], një përqendrim prej 1 mM IPA u zgjodh bazuar në përqendrimin më të lartë jo-toksik [15] dhe shkallën më të lartë të apoptozës, pa asnjë ndryshim në përqindjen e popullatës së qelizave nekrotike. Edhe pse nivelet suprafiziologjike të IPA-së u përdorën në këtë studim, aktualisht nuk ka konsensus në lidhje me dozën efektive të IPA-së [52]. Edhe pse rezultatet tona janë të rëndësishme, fati më i gjerë metabolik i IPA-së mbetet një fushë aktive kërkimore. Për më tepër, gjetjet tona mbi shoqërimin midis niveleve të IPA-së në serum dhe metilimit të ADN-së të transkripteve të mëlçisë u morën jo vetëm nga qelizat staminale hematopoietike (HSC), por edhe nga indet e mëlçisë. Ne zgjodhëm të përdorim qelizat njerëzore LX-2 bazuar në gjetjet tona të mëparshme nga analiza e transkriptomës se IPA është e lidhur me aktivizimin e qelizave staminale hematopoietike (HSC) [15], dhe HSC-të janë qelizat kryesore të përfshira në përparimin e fibrozës së mëlçisë. Mëlçia përbëhet nga lloje të shumëfishta qelizash, kështu që modele të tjera qelizore si sistemi i bashkëkulturës hepatocite-HSC-qeliza imune i kombinuar me aktivizimin e kaspazës dhe fragmentimin e ADN-së, si dhe mekanizmi i veprimit duke përfshirë nivelin e proteinave, duhet të merren në konsideratë për të studiuar rolin e IPA-së dhe ndërveprimin e saj me llojet e tjera të qelizave të mëlçisë.