Teoritë e ndryshme të mbrojtjes së bimëve ofrojnë udhëzime të rëndësishme teorike për të shpjeguar modelet e metabolizmit të specializuar të bimëve, por parashikimet e tyre kryesore mbeten për t'u testuar. Këtu, ne përdorëm analizën e paanshme të spektrometrisë masive tandem (MS/MS) për të eksploruar sistematikisht metabolomin e llojeve të dobësuara të duhanit nga bimë individuale në popullata dhe specie të lidhura ngushtë, dhe përpunuam një numër të madh teorish të karakteristikave spektrometrike masive bazuar në spektrat e përbërë në informacion. Kornizë për të testuar parashikimet kryesore të teorive të mbrojtjes optimale (OD) dhe objektivit lëvizës (MT). Komponenti i informacionit i metabolomikës së bimëve është në përputhje me teorinë OD, por bie ndesh me parashikimin kryesor të teorisë MT mbi dinamikën e metabolomikës të shkaktuar nga barngrënësit. Nga shkalla mikro në atë makro evolucionare, sinjali i jasmonatit u identifikua si përcaktuesi kryesor i OD, ndërsa sinjali i etilenit siguroi rregullim të imët të përgjigjes specifike të barngrënësit të shënuar nga rrjeti molekular MS/MS.
Metabolitët specialë me struktura të larmishme janë pjesëmarrësit kryesorë në përshtatjen e bimëve me mjedisin, veçanërisht në mbrojtje nga armiqtë (1). Diversifikimi i mahnitshëm i metabolizmit special që gjendet në bimë ka stimuluar dekada të tëra kërkimesh të thella mbi shumë aspekte të funksioneve ekologjike dhe ka formuar një listë të gjatë teorish mbrojtëse të bimëve, të cilat janë zhvillimi evolucionar dhe ekologjik i ndërveprimeve bimë-insekt. Hulumtimi empirik ofron udhëzime të rëndësishme (2). Megjithatë, këto teori mbrojtëse të bimëve nuk ndoqën rrugën normative të arsyetimit deduktiv hipotetik, në të cilin parashikimet kryesore ishin në të njëjtin nivel analize (3) dhe u testuan eksperimentalisht për të avancuar ciklin tjetër të zhvillimit teorik (4). Kufizimet teknike kufizojnë mbledhjen e të dhënave në kategori specifike metabolike dhe përjashtojnë analizën gjithëpërfshirëse të metabolitëve të specializuar, duke parandaluar kështu krahasimet ndërkategorike që janë thelbësore për zhvillimin teorik (5). Mungesa e të dhënave gjithëpërfshirëse të metabolomikës dhe një monedhe të përbashkët për të krahasuar rrjedhën e punës së përpunimit të hapësirës metabolike midis grupeve të ndryshme të bimëve pengon pjekurinë shkencore të fushës.
Zhvillimet më të fundit në fushën e metabolomikës së spektrometrisë së masës në tandem (MS/MS) mund të karakterizojnë në mënyrë gjithëpërfshirëse ndryshimet metabolike brenda dhe midis specieve të një klade të caktuar sistemi, dhe mund të kombinohen me metoda llogaritëse për të llogaritur ngjashmërinë strukturore midis këtyre përzierjeve komplekse. Njohuri paraprake të kimisë (5). Kombinimi i teknologjive të përparuara në analizë dhe informatikë ofron një kornizë të nevojshme për testimin afatgjatë të shumë parashikimeve të bëra nga teoritë ekologjike dhe evolucionare të diversitetit metabolik. Shannon (6) prezantoi teorinë e informacionit për herë të parë në artikullin e tij themelor në vitin 1948, duke hedhur themelet për analizën matematikore të informacionit, e cila është përdorur në shumë fusha të tjera përveç aplikimit të saj origjinal. Në gjenomikë, teoria e informacionit është aplikuar me sukses për të përcaktuar sasinë e informacionit konservativ të sekuencës (7). Në kërkimin e transkriptomikës, teoria e informacionit analizon ndryshimet e përgjithshme në transkriptomë (8). Në kërkimet e mëparshme, ne aplikuam kornizën statistikore të teorisë së informacionit në metabolomikë për të përshkruar ekspertizën metabolike të nivelit të indeve në bimë (9). Këtu, ne kombinojmë rrjedhën e punës të bazuar në MS/MS me kornizën statistikore të teorisë së informacionit, të karakterizuar nga diversiteti metabolik në monedhën e përbashkët, për të krahasuar parashikimet kryesore të teorisë së mbrojtjes së bimëve të metabolomes së induktuar nga barngrënësit.
Kornizat teorike të mbrojtjes së bimëve zakonisht janë reciprokisht përfshirëse dhe mund të ndahen në dy kategori: ato që përpiqen të shpjegojnë shpërndarjen e metabolitëve specifikë të bimëve bazuar në funksionet mbrojtëse, siç janë mbrojtja optimale (OD) (10), objektivi lëvizës (MT) (11) dhe teoria e pamjes (12), ndërsa të tjerat kërkojnë shpjegime mekanike se si ndryshimet në disponueshmërinë e burimeve ndikojnë në rritjen e bimëve dhe akumulimin e metabolitëve të specializuar, siç është karboni: hipoteza e ekuilibrit të lëndëve ushqyese (13), hipoteza e shkallës së rritjes (14) dhe hipoteza e ekuilibrit të rritjes dhe diferencimit (15). Dy grupet e teorive janë në nivele të ndryshme analize (4). Megjithatë, dy teori që përfshijnë funksione mbrojtëse në nivelin funksional dominojnë bisedën rreth mbrojtjeve përbërëse dhe të induktueshme të bimëve: teoria OD, e cila supozon se bimët investojnë në mbrojtjet e tyre të shtrenjta kimike vetëm kur është e nevojshme, për shembull, kur ato gëlltiten. Kur një kafshë bari sulmon, pra, sipas mundësisë së sulmit të ardhshëm, caktohet përbërja me një funksion mbrojtës (10); Hipoteza MT propozon që nuk ka një bosht të ndryshimit të drejtuar të metabolitit, por metaboliti ndryshon rastësisht, duke krijuar kështu mundësinë e pengimit të "objektivit të lëvizjes" metabolike të sulmit të barngrënësve. Me fjalë të tjera, këto dy teori bëjnë parashikime të kundërta në lidhje me rimodelimin metabolik që ndodh pas sulmit të barngrënësve: marrëdhënia midis akumulimit unidireksional të metabolitëve me funksion mbrojtës (OD) dhe ndryshimeve metabolike jo të drejtuara (MT) (11).
Hipotezat OD dhe MT përfshijnë jo vetëm ndryshimet e induktuara në metabolom, por edhe pasojat ekologjike dhe evolucionare të akumulimit të këtyre metabolitëve, siç janë kostot dhe përfitimet adaptive të këtyre ndryshimeve metabolike në një mjedis specifik ekologjik (16). Edhe pse të dyja hipotezat njohin funksionin mbrojtës të metabolitëve të specializuar, të cilët mund të jenë ose jo të kushtueshëm, parashikimi kryesor që dallon hipotezat OD dhe MT qëndron në drejtimin e ndryshimeve metabolike të induktuara. Parashikimi i teorisë OD ka marrë vëmendjen më të madhe eksperimentale deri më tani. Këto teste përfshijnë studimin e funksioneve mbrojtëse direkte ose indirekte të indeve të ndryshme të komponimeve specifike në serra dhe kushte natyrore, si dhe ndryshimet në fazën e zhvillimit të bimëve (17-19). Megjithatë, deri më tani, për shkak të mungesës së një kuadri rrjedhjeje pune dhe statistikor për analizën globale gjithëpërfshirëse të diversitetit metabolik të çdo organizmi, parashikimi kryesor i ndryshimit midis dy teorive (domethënë, drejtimi i ndryshimeve metabolike) mbetet për t'u testuar. Këtu, ne ofrojmë një analizë të tillë.
Një nga karakteristikat më domethënëse të metabolitëve specifikë të bimëve është diversiteti i tyre ekstrem strukturor në të gjitha nivelet, nga bimët e vetme, popullatat deri te speciet e ngjashme (20). Shumë ndryshime sasiore në metabolitët e specializuar mund të vërehen në shkallën e popullsisë, ndërsa dallimet e forta cilësore zakonisht mbahen në nivelin e specieve (20). Prandaj, diversiteti metabolik i bimëve është aspekti kryesor i diversitetit funksional, duke reflektuar përshtatshmërinë ndaj vendeve të ndryshme, veçanërisht atyre vendeve me mundësi të ndryshme pushtimi nga insektet speciale dhe barngrënësit e zakonshëm (21). Që nga artikulli inovativ i Fraenkel (22) mbi arsyet e ekzistencës së metabolitëve specifikë të bimëve, ndërveprimet me insekte të ndryshme janë konsideruar si presione të rëndësishme përzgjedhjeje, dhe këto ndërveprime besohet se kanë formësuar bimët gjatë evolucionit. Rruga metabolike (23). Dallimet ndërspecie në diversitetin e metabolitëve të specializuar mund të pasqyrojnë gjithashtu ekuilibrin fiziologjik të lidhur me mbrojtjen konstitutive dhe të induktueshme të bimëve kundër strategjive barngrënëse, pasi dy speciet shpesh janë të lidhura negativisht me njëra-tjetrën (24). Edhe pse mund të jetë e dobishme të ruhet një mbrojtje e mirë në çdo kohë, ndryshimet metabolike në kohë të lidhura me mbrojtjen ofrojnë përfitime të qarta në lejimin e bimëve të ndajnë burime të vlefshme për investime të tjera fiziologjike (19, 24) dhe shmangin nevojën për simbiozë. Dëmi kolateral (25). Përveç kësaj, këto riorganizime të metabolitëve të specializuar të shkaktuara nga insektet herbivore mund të çojnë në shpërndarje shkatërruese në popullatë (26) dhe mund të pasqyrojnë lexime të drejtpërdrejta të ndryshimeve të konsiderueshme natyrore në sinjalin e acidit jasmonik (JA), i cili mund të mbahet në popullatë. Sinjalet e larta dhe të ulëta të JA janë kompromise midis mbrojtjes kundër herbivorëve dhe konkurrencës me specie specifike (27). Përveç kësaj, shtigjet e specializuara të biosintezës së metabolitëve do të pësojnë humbje dhe transformim të shpejtë gjatë evolucionit, duke rezultuar në shpërndarje metabolike të çrregullt midis specieve të lidhura ngushtë (28). Këto polimorfizma mund të vendosen shpejt në përgjigje të ndryshimit të modeleve herbivore (29), që do të thotë se luhatja e komuniteteve herbivore është një faktor kyç që nxit heterogjenitetin metabolik.
Këtu, ne zgjidhëm konkretisht problemet e mëposhtme. (I) Si e rikonfiguron insekti barngrënës metabolomin e bimëve? (Ii) Cilat janë komponentët kryesorë të informacionit të plasticitetit metabolik që mund të përcaktohen për të testuar parashikimet e teorisë së mbrojtjes afatgjatë? (Iii) Nëse duhet të riprogramohet metabolomi i bimëve në një mënyrë unike për sulmuesin, nëse po, çfarë roli luan hormoni i bimëve në përshtatjen e një përgjigjeje specifike metabolike dhe cilët metabolitë kontribuojnë në specifikën e specieve të mbrojtjes? (Iv) Meqenëse parashikimet e bëra nga shumë teori mbrojtëse mund të shtrihen në të gjitha nivelet e indeve biologjike, ne pyetëm se sa konsistente është përgjigja metabolike e shkaktuar nga krahasimi i brendshëm në krahasimin ndërspecie? Për këtë qëllim, ne kemi studiuar sistematikisht metabolomin e gjetheve të nikotinës së duhanit, i cili është një bimë model ekologjik me metabolizëm të pasur dhe të specializuar, dhe është efektiv kundër larvave të dy barngrënësve vendas, Lepidoptera Datura (Ms) (Shumë agresive, kryesisht të ngrëna). Në Solanaceae dhe Spodoptera littoralis (Sl), krimbat e gjetheve të pambukut janë një lloj "gjinie", me bimët pritëse të Solanaceae dhe pritës të tjerë të gjinive dhe familjeve të tjera si ushqim bimor. Ne analizuam spektrin e metabolomikës MS/MS dhe nxorëm përshkruesit statistikorë të teorisë së informacionit për të krahasuar teoritë OD dhe MT. Krijuam harta specifikimi për të zbuluar identitetin e metabolitëve kryesorë. Analiza u zgjerua në popullatën vendase të N. nasi dhe specieve të lidhura ngushtë të duhanit për të analizuar më tej kovariancën midis sinjalizimit të hormoneve të bimëve dhe induksionit OD.
Për të kapur një hartë të përgjithshme rreth plasticitetit dhe strukturës së metabolomit të gjetheve të duhanit barngrënës, ne përdorëm një rrjedhë pune analizash dhe llogaritjesh të zhvilluar më parë për të mbledhur dhe dekonvoluar në mënyrë gjithëpërfshirëse spektrat MS/MS të pavarura me rezolucion të lartë nga ekstraktet bimore (9). Kjo metodë e padiferencuar (e quajtur MS/MS) mund të ndërtojë spektra përbërësish jo të tepërt, të cilët më pas mund të përdoren për të gjitha analizat në nivel përbërësish të përshkruara këtu. Këta metabolitë të bimëve të dekonvoluara janë të llojeve të ndryshme, që përbëhen nga qindra deri në mijëra metabolitë (rreth 500-1000-s/MS/MS këtu). Këtu, ne e konsiderojmë plasticitetin metabolik në kuadrin e teorisë së informacionit dhe përcaktojmë sasinë e diversitetit dhe profesionalizmit të metabolomit bazuar në entropinë Shannon të shpërndarjes së frekuencës metabolike. Duke përdorur formulën e zbatuar më parë (8), ne llogaritëm një sërë treguesish që mund të përdoren për të përcaktuar sasinë e diversitetit të metabolomit (treguesi Hj), specializimin e profilit metabolik (treguesi δj) dhe specifikën metabolike të një metaboliti të vetëm (treguesi Si). Përveç kësaj, ne aplikuam Indeksin e Plasticitetit të Distancës Relative (RDPI) për të përcaktuar sasinë e induktivitetit të metabolomes së barngrënësve (Figura 1A) (30). Brenda këtij kuadri statistikor, ne e trajtojmë spektrin MS/MS si njësinë bazë të informacionit dhe përpunojmë bollëkun relativ të MS/MS në një hartë të shpërndarjes së frekuencave dhe më pas përdorim entropinë Shannon për të vlerësuar diversitetin e metabolomes prej tij. Specializimi i metabolomes matet nga specifikimi mesatar i një spektri të vetëm MS/MS. Prandaj, rritja e bollëkut të disa klasave MS/MS pas induksionit të barngrënësve transformohet në induktivitet spektral, RDPI dhe specializim, domethënë, rritja e indeksit δj, sepse prodhohen metabolitë më të specializuar dhe prodhohet një indeks i lartë Si. Ulja e indeksit të diversitetit Hj pasqyron që ose numri i MS/MS të gjeneruara zvogëlohet, ose shpërndarja e frekuencës së profilit ndryshon në një drejtim më pak uniform, duke zvogëluar pasigurinë e saj të përgjithshme. Përmes llogaritjes së indeksit Si, është e mundur të nxirret në pah se cilat MS/MS induktohen nga disa barngrënës, dhe përkundrazi, cilat MS/MS nuk i përgjigjen induksionit, i cili është një tregues kyç për të dalluar parashikimin e MT dhe OD.
(A) Përshkruesit statistikorë të përdorur për induktivitetin e të dhënave MS/MS (RDPI) të barngrënësve (H1 deri në Hx), diversitetin (indeksi Hj), specializimin (indeksi δj) dhe specifikën e metabolitëve (indeksi Si). Një rritje në shkallën e specializimit (δj) tregon se, mesatarisht, do të prodhohen më shumë metabolitë specifikë barngrënës, ndërsa një rënie në diversitet (Hj) tregon një rënie në prodhimin e metabolitëve ose shpërndarje të pabarabartë të metabolitëve në hartën e shpërndarjes. Vlera e Si vlerëson nëse metaboliti është specifik për një gjendje të caktuar (këtu, barngrënës) apo anasjelltas mbahet në të njëjtin nivel. (B) Diagrama konceptuale e parashikimit të teorisë së mbrojtjes duke përdorur boshtin e teorisë së informacionit. Teoria OD parashikon që sulmi i barngrënësve do të rrisë metabolitët mbrojtës, duke rritur kështu δj. Në të njëjtën kohë, Hj zvogëlohet sepse profili riorganizohet drejt pasigurisë së reduktuar të informacionit metabolik. Teoria MT parashikon që sulmi i barngrënësve do të shkaktojë ndryshime jo të drejtuara në metabolom, duke rritur kështu Hj si një tregues i rritjes së pasigurisë së informacionit metabolik dhe duke shkaktuar një shpërndarje të rastësishme të Si. Ne gjithashtu propozuam një model të përzier, MT-në më të mirë, në të cilin disa metabolitë me vlera më të larta mbrojtëse do të rriten veçanërisht (vlerë e lartë e Si), ndërsa të tjerët shfaqin përgjigje të rastësishme (vlerë më e ulët e Si).
Duke përdorur përshkruesit e teorisë së informacionit, ne e interpretojmë teorinë OD për të parashikuar se ndryshimet e metabolitëve specialë të shkaktuar nga barngrënësit në një gjendje përbërëse të painduktuar do të çojnë në (i) një rritje të specifikës metabolike (indeksi Si) duke nxitur specifikën metabolomike (indeksi δj). Rritja e) grupeve të caktuara të metabolitëve specialë me vlerë më të lartë mbrojtëse, dhe (ii) ulja e diversitetit të metabolomeve (indeksi Hj) për shkak të ndryshimit të shpërndarjes së frekuencës metabolike në një shpërndarje më të madhe të trupit të leptinës. Në nivelin e një metaboliti të vetëm, pritet një shpërndarje e renditur e Si, ku metaboliti do të rrisë vlerën e Si sipas vlerës së tij mbrojtëse (Figura 1B). Në këtë linjë, ne e shpjegojmë teorinë MT për të parashikuar se ngacmimi do të çojë në (i) ndryshime jo të drejtuara në metabolite duke rezultuar në një ulje të indeksit δj, dhe (ii) një rritje të indeksit Hj për shkak të një rritjeje të pasigurisë metabolike. Ose rastësi, e cila mund të përcaktohet nga entropia Shannon në formën e diversitetit të përgjithësuar. Sa i përket përbërjes metabolike, teoria MT do të parashikojë shpërndarjen e rastësishme të Si. Duke marrë parasysh që metabolitë të caktuara janë në kushte specifike, ndërsa kushte të tjera nuk janë në kushte specifike, dhe vlera e tyre mbrojtëse varet nga mjedisi, ne gjithashtu propozuam një model të përzier mbrojtës, në të cilin δj dhe Hj shpërndahen në dy përgjatë Si. Rritja në të gjitha drejtimet, vetëm grupe të caktuara metabolitësh, të cilët kanë vlera më të larta mbrojtëse, do të rrisin veçanërisht Si, ndërsa të tjerët do të kenë një shpërndarje të rastësishme (Figura 1B).
Për të testuar parashikimin e ripërcaktuar të teorisë së mbrojtjes në boshtin e përshkruesit të teorisë së informacionit, ne kemi mbledhur larva herbivore eksperte (Ms) ose gjeneraliste (Sl) në gjethet e Nepenthes pallens (Figura 2A). Duke përdorur analizën MS/MS, ne kemi marrë 599 spektra jo-tepërt MS/MS (skedari i të dhënave S1) nga ekstraktet e metanolit të indeve të gjetheve të mbledhura pas ushqyerjes së vemjes. Përdorimi i indekseve RDPI, Hj dhe δj për të vizualizuar rikonfigurimin e përmbajtjes së informacionit në skedarët e konfigurimit MS/MS zbulon modele interesante (Figura 2B). Trendi i përgjithshëm është se, siç përshkruhet nga përshkruesi i informacionit, ndërsa vemjet vazhdojnë të hanë gjethe, shkalla e të gjithë riorganizimit metabolik rritet me kalimin e kohës: 72 orë pasi herbivori ha, RDPI rritet ndjeshëm. Krahasuar me kontrollin e padëmtuar, Hj u zvogëlua ndjeshëm, gjë që ishte për shkak të shkallës së rritur të specializimit të profilit metabolik, i cili u përcaktua nga indeksi δj. Ky trend i dukshëm është në përputhje me parashikimet e teorisë OD, por është në kundërshtim me parashikimet kryesore të teorisë MT, e cila beson se ndryshimet e rastësishme (jo të drejtuara) në nivelet e metabolitëve përdoren si një kamuflazh mbrojtës (Figura 1B). Edhe pse përmbajtja e nxitësit të sekretimit oral (OS) dhe sjellja e të ushqyerit e këtyre dy barngrënësve janë të ndryshme, ushqyerja e tyre e drejtpërdrejtë rezultoi në ndryshime të ngjashme në drejtimet e Hj dhe δj gjatë periudhave 24-orëshe dhe 72-orëshe të korrjes. I vetmi ndryshim ndodhi në 72 orët e RDPI. Krahasuar me atë të shkaktuar nga ushqyerja me Ms, metabolizmi i përgjithshëm i shkaktuar nga ushqyerja me Sl ishte më i lartë.
(A) Dizajni eksperimental: herbivorët derri i zakonshëm (S1) ose ekspertët (Ms) ushqehen me gjethe të çkripura të bimëve të shtambës, ndërsa për herbivorët e simuluar, OS e Ms (W + OSMs) përdoret për të trajtuar shpimin e pozicioneve standarde të gjetheve të plagosura. S1 (W + OSSl) larva ose ujë (W + W). Kontrolli (C) është një gjethe e padëmtuar. (B) Induktiviteti (RDPI krahasuar me grafikun e kontrollit), diversiteti (indeksi Hj) dhe indeksi i specializimit (indeksi δj) i llogaritur për hartën speciale të metabolitëve (599 MS/MS; skedari i të dhënave S1). Yjet tregojnë ndryshime të rëndësishme midis ushqyerjes direkte të herbivorëve dhe grupit të kontrollit (testi t i Studentit me testin t të çiftëzuar, *P<0.05 dhe ***P<0.001). ns, jo e rëndësishme. (C) Indeksi i rezolucionit kohor të spektrit kryesor (kutia blu, aminoacidi, acidi organik dhe sheqeri; skedari i të dhënave S2) dhe spektrit të metabolitëve specialë (kutia e kuqe 443 MS/MS; skedari i të dhënave S1) pas trajtimit të simuluar të barngrënësit. Brezi i ngjyrave i referohet intervalit të besimit 95%. Ylli tregon ndryshimin domethënës midis trajtimit dhe kontrollit [analiza kuadratike e variancës (ANOVA), e ndjekur nga ndryshimi i ndershëm domethënës i Tukey-t (HSD) për krahasime të shumëfishta post hoc, *P<0.05, **P<0.01 Dhe *** P <0.001]. (D) Specializimi i grafikëve të shpërndarjes dhe profileve të metabolitëve specialë (mostra të përsëritura me trajtime të ndryshme).
Për të eksploruar nëse rimodelim i shkaktuar nga barngrënësit në nivelin e metabolomit reflektohet në ndryshimet në nivelin e metabolitëve individualë, ne së pari u përqendruam në metabolitët e studiuar më parë në gjethet e Nepenthes pallens me rezistencë të provuar ndaj barngrënësve. Amidet fenolike janë konjugate hidroksicinnamamide-poliaminë që grumbullohen gjatë procesit të barngrënies së insekteve dhe dihet se zvogëlojnë performancën e insekteve (32). Ne kërkuam pararendësit e MS/MS përkatëse dhe vizatuam kurbat e tyre kinetike kumulative (Figura S1). Siç pritej, derivatet e fenolit që nuk janë të përfshira drejtpërdrejt në mbrojtjen kundër barngrënësve, siç janë acidi klorogjenik (CGA) dhe rutina, ulen pas barngrënies. Në të kundërt, barngrënësit mund t'i bëjnë amidet e fenolit shumë të fuqishme. Ushqyerja e vazhdueshme e dy barngrënësve rezultoi në pothuajse të njëjtin spektër ngacmimi të fenolamideve, dhe ky model ishte veçanërisht i dukshëm për sintezën de novo të fenolamideve. I njëjti fenomen do të vërehet kur të eksplorohet rruga e glikozideve diterpene 17-hidroksigeranil nonanediol (17-HGL-DTG), e cila prodhon një numër të madh diterpenesh aciklike me funksione efektive anti-barngrënëse (33), nga të cilat Ms Feeding me Sl shkaktoi një profil të ngjashëm shprehjeje (Figura S1).
Disavantazhi i mundshëm i eksperimenteve të ushqyerjes direkte të barngrënësve është ndryshimi në shkallën e konsumit të gjetheve dhe kohën e ushqyerjes së barngrënësve, gjë që e bën të vështirë eliminimin e efekteve specifike për barngrënësit të shkaktuara nga plagët dhe barngrënësit. Për të zgjidhur më mirë specifikën e specieve barngrënëse të përgjigjes metabolike të gjetheve të induktuara, ne simuluam ushqyerjen e larvave Ms dhe Sl duke aplikuar menjëherë OS-në e mbledhur fllad (OSM dhe OSS1) në shpimin standard W të pozicioneve konsistente të gjetheve. Kjo procedurë quhet trajtim W + OS, dhe standardizon induksionin duke kohëzuar saktësisht fillimin e përgjigjes së shkaktuar nga barngrënësi pa shkaktuar efekte konfuze të ndryshimeve në shkallën ose sasinë e humbjes së indeve (Figura 2A) (34). Duke përdorur analizën MS/MS dhe tubacionin e llogaritjes, ne morëm 443 spektra MS/MS (skedari i të dhënave S1), të cilat mbivendoseshin me spektrat e mbledhur më parë nga eksperimentet e ushqyerjes direkte. Analiza e teorisë së informacionit të këtij grupi të dhënash MS/MS tregoi se riprogramimi i metabolomeve të specializuara në gjethe duke simuluar barngrënësit tregoi induksione specifike për OS (Figura 2C). Në veçanti, krahasuar me trajtimin OSS1, OSM shkaktoi një rritje të specializimit të metabolomes në 4 orë. Vlen të përmendet se krahasuar me të dhënat eksperimentale të ushqyerjes direkte të barngrënësve, kinetika metabolike e vizualizuar në hapësirën dy-dimensionale duke përdorur Hj dhe δj si koordinata dhe drejtimi i specializimit të metabolomes në përgjigje të trajtimit të simuluar të barngrënësve me kalimin e kohës rritet në mënyrë të qëndrueshme (Figura 2D). Në të njëjtën kohë, ne përcaktuam sasinë e përmbajtjes së aminoacideve, acideve organike dhe sheqernave (skedari i të dhënave S2) për të hetuar nëse kjo rritje e synuar në ekspertizën e metabolomes është për shkak të rikonfigurimit të metabolizmit qendror të karbonit në përgjigje të barngrënësve të simuluar (Figura S2). Për ta shpjeguar më mirë këtë model, ne monitoruam më tej kinetikën e akumulimit metabolik të shtigjeve të fenolamideve dhe 17-HGL-DTG të diskutuara më parë. Induksioni specifik i OS i barngrënësve transformohet në një model rirregullimi diferencial brenda metabolizmit të fenolamideve (Figura S3). Amidet fenolike që përmbajnë pjesë kumarin dhe kafeoil induktohen në mënyrë preferenciale nga OSS1, ndërsa OSM-të shkaktojnë një induksion specifik të konjugateve ferulil. Për rrugën 17-HGL-DTG, u zbulua induksioni diferencial i OS nga produktet e malonilimit dhe dimalonilimit në rrjedhën e poshtme (Figura S3).
Më pas, ne studiuam plasticitetin e transkriptomës së induktuar nga OS duke përdorur të dhënat e mikroarray-it me kurs kohor, i cili simulon përdorimin e OSM-ve për të trajtuar gjethet e gjetheve të bimës rozetë te barngrënësit. Kinetika e marrjes së mostrave në thelb mbivendoset me kinetikën e përdorur në këtë studim metabolomik (35). Krahasuar me rikonfigurimin e metabolomit në të cilin plasticiteti metabolik rritet veçanërisht me kalimin e kohës, ne vërejmë shpërthime të përkohshme të transkriptimit në gjethe të induktuara nga Ms, ku induktiviteti i transkriptomës (RDPI) dhe specializimi (δj) janë në 1. Pati një rritje të konsiderueshme në orë dhe diversitet (Hj) në këtë pikë kohore, shprehja e BMP1 u zvogëlua ndjeshëm, e ndjekur nga relaksimi i specializimit të transkriptomës (Figura S4). Familjet e gjeneve metabolike (të tilla si P450, glikoziltransferaza dhe aciltransferaza BAHD) marrin pjesë në procesin e montimit të metabolitëve specialë nga njësitë strukturore të nxjerra nga metabolizmi primar, duke ndjekur modelin e hershëm të specializimit të lartë të lartpërmendur. Si një studim rasti, u analizua rruga e fenilalaninës. Analiza konfirmoi se gjenet kryesore në metabolizmin e fenolamideve janë shumë të induktuara nga OS te barngrënësit krahasuar me bimët e pa tërhequra, dhe janë të lidhura ngushtë në modelet e tyre të shprehjes. Faktori i transkriptimit MYB8 dhe gjenet strukturore PAL1, PAL2, C4H dhe 4CL në rrjedhën e sipërme të kësaj rruge treguan fillim të hershëm të transkriptimit. Aciltransferazat që luajnë një rol në montimin përfundimtar të fenolamideve, të tilla si AT1, DH29 dhe CV86, shfaqin një model të zgjatur të rritjes (Figura S4). Vëzhgimet e mësipërme tregojnë se fillimi i hershëm i specializimit të transkriptomit dhe rritja e mëvonshme e specializimit metabolomik janë një mënyrë e çiftëzuar, e cila mund të jetë për shkak të sistemit rregullator sinkron që fillon një përgjigje të fuqishme mbrojtëse.
Rikonfigurimi në sinjalizimin e hormoneve të bimëve vepron si një shtresë rregullatore që integron informacionin herbivor për të riprogramuar fiziologjinë e bimëve. Pas simulimit të herbivorëve, ne matëm dinamikën kumulative të kategorive kryesore të hormoneve të bimëve dhe vizualizuam bashkë-shprehjen kohore midis tyre [Koeficienti i korrelacionit Pearson (PCC)> 0.4] (Figura 3A). Siç pritej, hormonet e bimëve që lidhen me biosintezën janë të lidhura brenda rrjetit të bashkë-shprehjes së hormoneve të bimëve. Përveç kësaj, specifikimi metabolik (indeksi Si) është hartëzuar në këtë rrjet për të nxjerrë në pah hormonet e bimëve të induktuara nga trajtime të ndryshme. Janë vizatuar dy fusha kryesore të përgjigjes specifike të herbivorëve: njëra është në grumbullin JA, ku JA (forma e tij biologjikisht aktive JA-Ile) dhe derivatet e tjera të JA tregojnë rezultatin më të lartë të Si; tjetra është etileni (ET). Giberelina tregoi vetëm një rritje të moderuar në specifikimin e herbivorëve, ndërsa hormonet e tjera të bimëve, të tilla si citokinina, auksina dhe acidi abscisik, kishin specifikim të ulët të induksionit për herbivorët. Krahasuar me përdorimin vetëm të W + W, amplifikimi i vlerës maksimale të derivateve të JA përmes aplikacionit OS (W + OS) në thelb mund të transformohet në një tregues të fortë specifik të JA-ve. Papritur, OSM dhe OSS1 me përmbajtje të ndryshme të nxitësit dihet se shkaktojnë akumulim të ngjashëm të JA dhe JA-Ile. Në ndryshim nga OSS1, OSM induktohet në mënyrë specifike dhe të fortë nga OSM-të, ndërsa OSS1 nuk amplifikon përgjigjen e plagëve bazale (Figura 3B).
(A) Analiza e rrjetit të bashkë-shprehjes bazuar në llogaritjen PCC të simulimit të kinetikës së akumulimit të hormoneve të bimëve të induktuara nga barngrënësit. Nyja përfaqëson një hormon të vetëm bimor, dhe madhësia e nyjës përfaqëson indeksin Si specifik për hormonin e bimëve midis trajtimeve. (B) Akumulimi i JA, JA-Ile dhe ET në gjethe të shkaktuara nga trajtime të ndryshme të treguara nga ngjyra të ndryshme: kajsi, W + OSM; blu, W + OSSl; e zezë, W + W; gri, C (kontroll). Yjet tregojnë ndryshime të rëndësishme midis trajtimit dhe kontrollit (ANOVA dypalëshe e ndjekur nga krahasimi i shumëfishtë Tukey HSD post hoc, *** P <0.001). Analiza e teorisë së informacionit të (C)697 MS/MS (skedari i të dhënave S1) në biosintezën JA dhe spektrin e perceptimit të dëmtuar (irAOC dhe irCOI1) dhe (D)585 MS/MS (skedari i të dhënave S1) në ETR1 me sinjal ET të dëmtuar. Dy trajtime të simuluara të barngrënësve shkaktuan linja bimore dhe bimë kontrolli të automjeteve bosh (EV). Yjet tregojnë ndryshime të rëndësishme midis trajtimit W+OS dhe kontrollit të padëmtuar (ANOVA dypalëshe e ndjekur nga krahasimi i shumëfishtë post hoc i Tukey HSD, *P<0.05, **P<0.01 dhe ***P<0.001). (E) Grafikë të shpërndarë të kundërshtimit të shpërndarë ndaj specializimit. Ngjyrat përfaqësojnë lloje të ndryshme të modifikuara gjenetikisht; simbolet përfaqësojnë metoda të ndryshme trajtimi: trekëndësh, W + OSS1; drejtkëndësh, W + OSM; rrethi C
Më pas, ne përdorim një lloj të modifikuar gjenetikisht të Nepenthes të dobësuar (irCOI1 dhe sETR1) në hapat kryesorë të biosintezës JA dhe ET (irAOC dhe irACO) dhe perceptimit (irCOI1 dhe sETR1) për të analizuar metabolizmin e këtyre dy hormoneve bimore te barngrënësit. Kontributi relativ i riprogramimit. Në përputhje me eksperimentet e mëparshme, ne konfirmuam induksionin e herbivore-OS në bimët bartëse bosh (EV) (Figura 3, C deri në D) dhe rënien e përgjithshme të indeksit Hj të shkaktuar nga OSM, ndërsa indeksi δj u rrit. Përgjigja është më e theksuar se përgjigja e shkaktuar nga OSS1. Një grafik me dy rreshta duke përdorur Hj dhe δj si koordinata tregon çrregullimin specifik (Figura 3E). Trendi më i dukshëm është se në llojet që nuk kanë sinjal JA, ndryshimet e diversitetit të metabolomeve dhe specializimit të shkaktuara nga barngrënësit janë pothuajse plotësisht të eliminuara (Figura 3C). Në të kundërt, perceptimi i heshtur i ET në bimët sETR1, megjithëse efekti i përgjithshëm në ndryshimet në metabolizmin herbivorë është shumë më i ulët se ai i sinjalizimit JA, zvogëlon ndryshimin në indekset Hj dhe δj midis ngacmimeve OSM dhe OSS1 (Figura 3D dhe Figura S5). Kjo tregon se përveç funksionit kryesor të transduksionit të sinjalit JA, transduksioni i sinjalit ET shërben gjithashtu si një rregullim i imët i përgjigjes metabolike specifike të specieve të herbivorëve. Në përputhje me këtë funksion rregullimi të imët, nuk kishte ndryshim në induktivitetin e përgjithshëm të metabolomes në bimët sETR1. Nga ana tjetër, krahasuar me bimët sETR1, bimët irACO shkaktuan amplituda të ngjashme të përgjithshme të ndryshimeve metabolike të shkaktuara nga herbivorët, por treguan rezultate Hj dhe δj dukshëm të ndryshme midis sfidave OSM dhe OSS1 (Figura S5).
Për të identifikuar metabolitët e specializuar që kanë kontribute të rëndësishme në përgjigjen specifike të specieve të barngrënësve dhe për të përmirësuar prodhimin e tyre përmes sinjaleve ET, ne përdorëm metodën strukturore MS/MS të zhvilluar më parë. Kjo metodë mbështetet në metodën e bi-grupimit për të ri-nxjerrë familjen metabolike nga fragmentet MS/MS [produkti i pikave të normalizuara (NDP)] dhe rezultati i ngjashmërisë bazuar në humbjen neutrale (NL). Seti i të dhënave MS/MS i ndërtuar përmes analizës së linjave transgjenike ET prodhoi 585 MS/MS (skedari i të dhënave S1), i cili u zgjidh duke i grupuar ato në shtatë module kryesore MS/MS (M) (Figura 4A). Disa nga këto module janë të mbushura dendur me metabolitë të veçantë të karakterizuar më parë: për shembull, M1, M2, M3, M4 dhe M7 janë të pasura me derivate të ndryshme fenoli (M1), glikozide flavonoide (M2), sheqerna acil (M3 dhe M4) dhe 17-HGL-DTG (M7). Përveç kësaj, informacioni specifik metabolik (indeksi Si) i një metaboliti të vetëm në secilin modul llogaritet, dhe shpërndarja e tij e Si mund të shihet në mënyrë intuitive. Shkurt, spektrat MS/MS që shfaqin specifikë të lartë barngrënëse dhe gjenotipi karakterizohen nga vlera të larta Si, dhe statistikat e kurtozës tregojnë shpërndarjen e qimeve në këndin e djathtë të bishtit. Një shpërndarje e tillë e koloideve të ligët u zbulua në M1, në të cilën fenol amid tregoi fraksionin më të lartë të Si (Figura 4B). 17-HGL-DTG i induktueshëm barngrënës i përmendur më parë në M7 tregoi një rezultat të moderuar Si, duke treguar një shkallë të moderuar të rregullimit diferencial midis dy llojeve OS. Në të kundërt, shumica e metabolitëve të specializuar të prodhuar në mënyrë konstitutive, të tilla si rutina, CGA dhe sheqernat acil, janë ndër rezultatet më të ulëta të Si. Për të eksploruar më mirë kompleksitetin strukturor dhe shpërndarjen e Si midis metabolitëve të veçantë, u ndërtua një rrjet molekular për secilin modul (Figura 4B). Një parashikim i rëndësishëm i teorisë OD (i përmbledhur në Figurën 1B) është se riorganizimi i metabolitëve specialë pas herbivorëve duhet të çojë në ndryshime njëkahëshe në metabolitët me vlerë të lartë mbrojtëse, veçanërisht duke rritur specifikën e tyre (në krahasim me shpërndarjen e rastësishme) Metabolit mbrojtës i parashikuar nga teoria MT. Shumica e derivateve të fenolit të akumuluara në M1 lidhen funksionalisht me rënien e performancës së insekteve (32). Kur krahasuam vlerat e Si në metabolitët M1 midis gjetheve të induktuara dhe gjetheve përbërëse të bimëve të kontrollit EV në 24 orë, vumë re se specifikimi metabolik i shumë metabolitëve pas insekteve herbivore ka një trend të konsiderueshëm në rritje (Figura 4C). Rritja specifike e vlerës së Si u zbulua vetëm në fenolamide mbrojtëse, por nuk u zbulua asnjë rritje në vlerën e Si në fenole të tjera dhe metabolite të panjohura që bashkëjetojnë në këtë modul. Ky është një model i specializuar, i cili lidhet me teorinë OD. Parashikimet kryesore të ndryshimeve metabolike të shkaktuara nga herbivorët janë konsistente. Për të testuar nëse kjo veçanti e spektrit të fenolamideve u induktua nga ET specifike për OS, ne paraqitëm grafikisht indeksin e metabolitit Si dhe shkaktuam një vlerë diferenciale të shprehjes midis OSM dhe OSS1 në gjenotipet EV dhe sETR1 (Figura 4D). Në sETR1, ndryshimi i induktuar nga fenamidet midis OSM dhe OSS1 u zvogëlua shumë. Metoda e bi-grupimit u aplikua gjithashtu në të dhënat MS/MS të mbledhura në shtame me JA të pamjaftueshme për të nxjerrë përfundimet kryesore të moduleve MS/MS që lidhen me specializimin metabolik të rregulluar nga JA (Figura S6).
(A) Rezultatet e grupimit të 585 MS/MS bazuar në fragmentin e përbashkët (ngjashmëria e NDP) dhe humbjen e përbashkët neutrale (ngjashmëria e NL) rezultojnë në modulin (M) që është në përputhje me familjen e njohur të përbërjeve, ose nga përbërja e metabolitëve të panjohur ose të metabolizuar dobët. Pranë secilit modul, tregohet shpërndarja specifike e metabolitit (MS/MS) (Si). (B) Rrjeti molekular modular: Nyjet përfaqësojnë MS/MS dhe skajet, rezultatet e NDP (të kuqe) dhe NL (blu) MS/MS (kufiri, > 0.6). Indeksi i graduar i specifikës së metabolitit (Si) i ngjyrosur bazuar në modul (majtas) dhe i hartuar në rrjetin molekular (djathtas). (C) Moduli M1 i bimës EV në gjendje konstitutive (kontroll) dhe të induktuar (barngrënës i simuluar) në 24 orë: diagrama e rrjetit molekular (vlera e Si është madhësia e nyjes, fenolamidi mbrojtës është i theksuar me blu). (D) Diagrama e rrjetit molekular M1 e vijës së spektrit sETR1 me perceptim të dëmtuar të EV dhe ET: përbërja fenolik e përfaqësuar nga nyja e rrethit të gjelbër, dhe ndryshimi i rëndësishëm (vlera P) midis trajtimeve W + OSM dhe W + OSS1 si madhësia e nyjes. CP, N-kafeoil-tirozinë; CS, N-kafeoil-spermidinë; FP, ester i acidit N-ferulik-acid urik; FS, N-ferulil-spermidinë; CoP, N', N “-Kumarolil-tirozinë; DCS, N', N”-dikafefoil-spermidinë; CFS, N', N”-kafeoil, feruloil-spermidinë; Lycium barbarum në manaferrën e ujkut Son; Nick. O-AS, sheqer O-acil.
Ne e zgjeruam më tej analizën nga një gjenotip i vetëm i dobësuar i Nepenthes në popullatat natyrore, ku ndryshime të forta intraspecifike në nivelet e JA-ve herbivore dhe nivelet specifike të metabolitëve janë përshkruar më parë në popullatat natyrore (26). Përdorni këtë grup të dhënash për të mbuluar 43 germoplazma. Këto germoplazma përbëhen nga 123 lloje bimësh nga N. pallens. Këto bimë u morën nga fara të mbledhura në habitate të ndryshme vendase në Utah, Nevada, Arizona dhe Kaliforni (Figura S7), ne llogaritëm diversitetin e metabolomeve (këtu i quajtur niveli i popullatës) (β diversiteti) dhe specializimin e shkaktuar nga OSM. Në përputhje me studimet e mëparshme, ne vëzhguam një gamë të gjerë ndryshimesh metabolike përgjatë boshteve Hj dhe δj, duke treguar se germoplazmat kanë dallime të rëndësishme në plasticitetin e përgjigjeve të tyre metabolike ndaj herbivorëve (Figura S7). Ky organizim kujton vëzhgimet e mëparshme në lidhje me gamën dinamike të ndryshimeve të JA-ve të shkaktuara nga herbivorët dhe ka ruajtur një vlerë shumë të lartë në një popullatë të vetme (26, 36). Duke përdorur JA dhe JA-Ile për të testuar korrelacionin e nivelit të përgjithshëm midis Hj dhe δj, zbuluam se ekziston një korrelacion pozitiv domethënës midis JA dhe indeksit të diversitetit dhe specializimit të metabolomes β (Figura S7). Kjo sugjeron që heterogjeniteti i shkaktuar nga herbivorët në induksionin e JA-ve i zbuluar në nivel popullate mund të jetë për shkak të polimorfizmave kryesore metabolike të shkaktuara nga përzgjedhja nga herbivorët insekte.
Studimet e mëparshme kanë treguar se llojet e duhanit ndryshojnë shumë në lloj dhe varësi relative nga mbrojtjet metabolike të induktuara dhe konstitutive. Besohet se këto ndryshime në transduksionin e sinjalit anti-barngrënës dhe aftësitë mbrojtëse rregullohen nga presioni i popullatës së insekteve, cikli jetësor i bimëve dhe kostot e prodhimit mbrojtës në kamaren ku rritet një specie e caktuar. Ne studiuam qëndrueshmërinë e rimodelimit të metabolomes së gjetheve të induktuar nga barngrënësit e gjashtë specieve Nicotiana vendase në Amerikën e Veriut dhe Amerikën e Jugut. Këto specie janë të lidhura ngushtë me Nepenthes të Amerikës së Veriut, përkatësisht Nicoli Bociflo. La, N. nicotinis, bari i dobësuar Nicotiana n., Nicotiana tabacum, duhani linear, duhani (Nicotiana spegazzinii) dhe duhani i gjetheve të duhanit (Nicotiana obtusifolia) (Figura 5A) (37). Gjashtë nga këto specie, duke përfshirë speciet e karakterizuara mirë N. please, janë bimë njëvjeçare të kladës së petunisë, dhe obtusifolia N. janë bimë shumëvjeçare të kladës simotër Trigonophyllae (38). Më pas, induksioni W + W, W + OSM dhe W + OSS1 u krye në këto shtatë specie për të studiuar rirregullimin metabolik në nivel specie të ushqyerjes së insekteve.
(A) Një pemë filogjenetike bootstrap bazuar në gjasat maksimale [për sintezën bërthamore të glutaminës (38)] dhe shpërndarjen gjeografike të shtatë specieve të lidhura ngushtë Nicotiana (ngjyra të ndryshme) (37). (B) Një grafik shpërndarjeje i diversitetit të specializuar për profilet metabolike të shtatë specieve Nicotiana (939 MS/MS; skedari i të dhënave S1). Në nivelin e specieve, diversiteti i metabolomit është negativisht i korreluar me shkallën e specializimit. Analiza e korrelacionit në nivel specie midis diversitetit metabolik dhe specializimit dhe akumulimit JA është treguar në Figurën 2. S9. Ngjyra, lloje të ndryshme; trekëndësh, W + OSS1; drejtkëndësh, W + OSM; (C) Dinamika e Nicotiana JA dhe JA-Ile renditet sipas amplitudës së ngacmimit OS (ANOVA dy-drejtimëshe dhe Tukey HSD pas krahasimit të shumëfishtë, * P <0.05, ** P <0.01 dhe * ** Për krahasimin e W + OS dhe W + W, P <0.001). Grafiku në formë kutie i diversitetit (D) dhe specializimit (E) të secilës specie pas simulimit të barngrënësve dhe metil JA (MeJA). Ylli tregon ndryshimin domethënës midis W + OS dhe W + W ose lanolinës plus W (Lan + W) ose Lan plus MeJA (Lan + MeJa) dhe kontrollit Lan (analiza dypalëshe e variancës, e ndjekur nga krahasimi i shumëfishtë post hoc i Tukey-t HSD, *P<0.05, **P<0.01 dhe ***P<0.001).
Duke përdorur metodën e grumbullimit të dyfishtë, ne identifikuam 9 module nga 939 MS/MS (skedari i të dhënave S1). Përbërja e MS/MS e rikonfiguruar nga trajtime të ndryshme ndryshon shumë midis moduleve të ndryshme midis specieve (Figura S8). Vizualizimi i Hj (i referuar këtu si γ-diversitet në nivel specie) dhe δj zbulon se specie të ndryshme grumbullohen në grupe shumë të ndryshme në hapësirën metabolike, ku ndarja në nivel specie është zakonisht më e spikatur sesa ngacmimi. Me përjashtim të N. linear dhe N. obliquus, ato shfaqin një gamë të gjerë dinamike të efekteve të induksionit (Figura 5B). Në të kundërt, specie të tilla si N. purpurea dhe N. obtusifolia kanë një përgjigje metabolike më pak të dukshme ndaj trajtimit, por metaboloma është më e larmishme. Shpërndarja specifike e specieve e përgjigjes metabolike të induktuar rezultoi në një korrelacion të rëndësishëm negativ midis specializimit dhe diversitetit gama (PCC = -0.46, P = 4.9×10-8). Ndryshimet e shkaktuara nga OS në nivelet e JAs janë të lidhura pozitivisht me specializimin e metabolomes dhe të lidhura negativisht me diversitetin gama metabolik të shfaqur nga secila specie (Figura 5B dhe Figura S9). Vlen të përmendet se speciet e referuara në mënyrë të folur si specie "përgjigje ndaj sinjalit" në Figurën 5C, të tilla si Nepenthes nematodes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute dhe Nepenthes attenuated, shkaktuan shenja të rëndësishme në 30 minuta. Shpërthimet e fundit të JA dhe JA-Ile specifike për OS, ndërsa bakteret e tjera të quajtura "të papërgjigjura ndaj sinjalit", të tilla si Nepenthes mills, Nepenthes powdery dhe N. obtusifolia tregojnë vetëm induksion JA-Ile Edge pa ndonjë specifikë të OS (Figura 5C). Në nivelin metabolik, siç u përmend më sipër, për Nepenthes të dobësuar, substancat që i përgjigjen sinjalit treguan specifikë të OS dhe rritën ndjeshëm δj, duke zvogëluar Hj. Ky efekt fillestar specifik i OS-së nuk u zbulua në speciet e klasifikuara si specie jo-reaktive ndaj sinjalit (Figura 5, D dhe E). Metabolitët specifikë të OS-së ndahen më shpesh midis specieve që i përgjigjen sinjalit, dhe këto grumbuj sinjalesh grumbullohen me speciet me përgjigje më të dobëta të sinjalit, ndërsa speciet me përgjigje më të dobëta të sinjalit tregojnë më pak ndërvarësi (Figura S8). Ky rezultat tregon se induksioni specifik i OS-së i JA-ve dhe rikonfigurimi specifik i OS-së i metabolomit në rrjedhën e poshtme janë të çiftëzuara në nivelin e specieve.
Më pas, ne përdorëm një pastë lanoline që përmbante metil JA (MeJA) për të trajtuar bimët për të hetuar nëse këto mënyra çiftëzimi janë të kufizuara nga disponueshmëria e JA të aplikuar nga JA ekzogjene, e cila do të jetë në citoplazmën e bimëve. Deesterifikimi i shpejtë është JA. Ne gjetëm të njëjtën tendencë të ndryshimit gradual nga speciet që i përgjigjen sinjalit në speciet që nuk i përgjigjen sinjalit të shkaktuara nga furnizimi i vazhdueshëm i JA (Figura 5, D dhe E). Shkurt, trajtimi me MeJA riprogramoi fuqishëm metabolomet e nematodave lineare, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens dhe N. mikimotoi, duke rezultuar në një rritje të konsiderueshme të δj dhe një rënie të Hj. N. purpurea tregoi vetëm një rritje të δj, por jo Hj. N. obtusifolia, e cila më parë është treguar se grumbullon nivele jashtëzakonisht të ulëta të JA-ve, gjithashtu i përgjigjet dobët trajtimit me MeJA për sa i përket rikonfigurimit të metabolomit. Këto rezultate tregojnë se prodhimi i JA ose transduksioni i sinjalit është i kufizuar fiziologjikisht në speciet që nuk i përgjigjen sinjalit. Për të testuar këtë hipotezë, ne studiuam katër speciet (N. pallens, N. mills, N. pink dhe N. microphylla) të induktuara nga W + W, W + OSM dhe W + OSS1 Transcriptome (39). Në përputhje me modelin e rimodelimit të metabolomit, speciet janë të ndara mirë në hapësirën e transkriptomës, midis të cilave N. attenuated tregoi RDPI më të lartë të induktuar nga OS, ndërsa N. gracilis kishte më të ulëtin (Figura 6A). Megjithatë, u zbulua se diversiteti i transkriptomës i induktuar nga N. oblonga ishte më i ulëti midis katër specieve, në kundërshtim me diversitetin më të lartë metabonomik të N. oblonga të treguar më parë në shtatë specie. Studimet e mëparshme kanë treguar se një grup gjenesh të lidhura me sinjalet e hershme të mbrojtjes, duke përfshirë sinjalet JA, shpjegon specifikën e përgjigjeve të hershme të mbrojtjes të induktuara nga eliktorët e lidhur me herbivorët në speciet Nicotiana (39). Krahasimi i shtigjeve të sinjalizimit JA midis këtyre katër specieve zbuloi një model interesant (Figura 6B). Shumica e gjeneve në këtë rrugë, të tilla si AOC, OPR3, ACX dhe COI1, treguan nivele relativisht të larta të induksionit në këto katër specie. Megjithatë, një gjen kyç, JAR4, e shndërron JA në formën e tij biologjikisht aktive të transkripteve të akumuluara nga JA-Ile, dhe niveli i tij i transkriptimit është shumë i ulët, veçanërisht në N. mills, Nepenthes pieris dhe N. microphylla. Përveç kësaj, vetëm transkripti i një gjeni tjetër AOS nuk u zbulua në N. bifidum. Këto ndryshime në shprehjen e gjeneve mund të jenë përgjegjëse për fenotipet ekstreme të shkaktuara nga prodhimi i ulët i JA në speciet anergjike të sinjalit dhe induksioni i N. gracilis.
(A) Analiza e teorisë së informacionit mbi riprogramimin e përgjigjeve të hershme transkriptuese të katër specieve të duhanit të lidhura ngushtë të marra si mostra 30 minuta pas induksionit të barngrënësit. RDPI llogaritet duke krahasuar gjethet e induktuara nga OS i barngrënësit me kontrollin e plagës. Ngjyrat tregojnë specie të ndryshme, dhe simbolet tregojnë metoda të ndryshme trajtimi. (B) Analiza e shprehjes së gjenit në shtigjet e sinjalizimit JA midis katër specieve. Shtegu i thjeshtuar JA tregohet pranë grafikut të kutisë. Ngjyra të ndryshme tregojnë metoda të ndryshme përpunimi. Ylli tregon se ka një ndryshim të rëndësishëm midis trajtimit W + OS dhe kontrollit W + W (për testin t të Studentit për ndryshimet në çifte, *P<0.05, **P<0.01 dhe ***P<0.001). OPDA, acid 12-oksofitodienoik; OPC-8: acid 0,3-okso-2(2′(Z)-pentenil)-ciklopentan-1-oktanoik.
Në pjesën e fundit, ne studiuam se si rimodelim specifik i specieve të insekteve të metabolomit të specieve të ndryshme bimore mund të jetë rezistent ndaj barngrënësve. Hulumtimet e mëparshme theksuan gjininë Nicotiana. Rezistenca e tyre ndaj Ms dhe larvave ndryshon shumë (40). Këtu, ne studiuam lidhjen midis këtij modeli dhe plasticitetit të tyre metabolik. Duke përdorur katër speciet e mësipërme të duhanit, dhe duke testuar korrelacionin midis diversitetit dhe specializimit të metabolomit të shkaktuar nga barngrënësit dhe rezistencës së bimëve ndaj Ms dhe Sl, ne zbuluam se rezistenca, diversiteti dhe specializimi ndaj Sl gjeneralist All janë të lidhura pozitivisht, ndërsa korrelacioni midis rezistencës ndaj zonjave eksperte dhe specializimit është i dobët, dhe korrelacioni me diversitetin nuk është i rëndësishëm (Figura S10). Lidhur me rezistencën ndaj S1, si N. chinensis i dobësuar ashtu edhe N. gracilis, të cilat më parë u treguan se shfaqnin si nivele të transduksionit të sinjalit JA ashtu edhe plasticitet të metabolomit, kishin përgjigje shumë të ndryshme ndaj induksionit të barngrënësve, dhe ato gjithashtu treguan rezistencë të ngjashme të lartë. Seksi.
Në gjashtëdhjetë vitet e fundit, teoria e mbrojtjes së bimëve ka ofruar një kornizë teorike, bazuar në të cilën studiuesit kanë parashikuar një numër të konsiderueshëm të evolucionit dhe funksioneve të metabolitëve të specializuar të bimëve. Shumica e këtyre teorive nuk ndjekin procedurën normale të inferencave të forta (41). Ato propozojnë parashikime kyçe (3) në të njëjtin nivel analize. Kur testimi i parashikimeve kyçe lejon që teoritë specifike të analizohen, kjo do të bëjë që fusha po ecën përpara. Mbështetuni, por refuzoni të tjerat (42). Në vend të kësaj, teoria e re bën parashikime në nivele të ndryshme analize dhe shton një shtresë të re konsideratash përshkruese (42). Megjithatë, dy teoritë e propozuara në nivelin funksional, MT dhe OD, mund të shpjegohen lehtësisht si parashikime të rëndësishme të ndryshimeve të specializuara metabolike të shkaktuara nga barngrënësit: Teoria OD beson se ndryshimet në "hapësirën" e specializuar metabolike janë shumë të drejtuara. Teoria MT beson se këto ndryshime do të jenë jo të drejtuara dhe të vendosura rastësisht në hapësirën metabolike, dhe kanë tendencë të kenë metabolitë me vlerë të lartë mbrojtëse. Ekzaminimet e mëparshme të parashikimeve OD dhe MT janë testuar duke përdorur një grup të ngushtë të komponimeve "mbrojtëse" a priori. Këto teste të përqendruara në metabolite pengojnë aftësinë për të analizuar shkallën dhe trajektoren e rikonfigurimit të metabolomit gjatë barngrënies, dhe nuk lejojnë që testimi brenda një kuadri statistikor konsistent të kërkojë parashikime kyçe që mund të konsiderohen si një e tërë. Përcaktoni sasinë e ndryshimeve në metabolomin e bimëve. Këtu, ne përdorëm teknologjinë inovative në metabolomikë bazuar në MS llogaritëse dhe kryem analizën MS të dekonvolucionit në monedhën e përgjithshme të përshkruesve të teorisë së informacionit për të testuar dallimin midis dy të propozuarve në nivelin global të metabolomikës. Parashikimi kryesor i kësaj teorie. Teoria e informacionit është aplikuar në shumë fusha, veçanërisht në kontekstin e biodiversitetit dhe kërkimit të rrjedhës së lëndëve ushqyese (43). Megjithatë, për aq sa dimë ne, ky është aplikimi i parë i përdorur për të përshkruar hapësirën e informacionit metabolik të bimëve dhe për të zgjidhur problemet ekologjike që lidhen me ndryshimet e përkohshme metabolike në përgjigje të sinjaleve mjedisore. Në veçanti, aftësia e kësaj metode qëndron në aftësinë e saj për të krahasuar modelet brenda dhe midis specieve bimore për të shqyrtuar se si barngrënësit kanë evoluar nga specie të ndryshme në modele makroevolucionare ndërspecie në nivele të ndryshme të evolucionit. Metabolizmi.
Analiza kryesore e komponentëve (PCA) konverton një grup të dhënash shumëvariabël në një hapësirë ​​reduktimi të dimensionalitetit në mënyrë që të mund të shpjegohet tendenca kryesore e të dhënave, kështu që zakonisht përdoret si një teknikë eksploruese për të analizuar grupin e të dhënave, siç është metaboloma e dekonvolucionit. Megjithatë, reduktimi i dimensionalitetit do të humbasë një pjesë të përmbajtjes së informacionit në grupin e të dhënave, dhe PCA nuk mund të ofrojë informacion sasior në lidhje me karakteristikat që janë veçanërisht të rëndësishme për teorinë ekologjike, të tilla si: si e rikonfigurojnë barngrënësit diversitetin në fusha të specializuara (për shembull, pasuria, shpërndarja) dhe bollëku) metabolitët? Cilët metabolitë janë parashikues të gjendjes së induktuar të një barngrënësi të caktuar? Nga perspektiva e specifikës, diversitetit dhe induktivitetit, përmbajtja e informacionit të profilit të metabolitit specifik të gjethes dekompozohet, dhe zbulohet se ngrënia e barngrënësve mund të aktivizojë metabolizmin specifik. Papritur, ne vumë re se, siç përshkruhet në treguesit e teorisë së informacionit të zbatuar, situata metabolike që rezulton ka një mbivendosje të madhe pas sulmeve të dy barngrënësve (gjeneralistja e ushqyer natën Sl) dhe ekspertja Solanaceae znj. Megjithëse sjellja dhe përqendrimi i tyre i të ushqyerit janë dukshëm të ndryshme. Iniciatori i konjugatit të acidit yndyror-aminoacideve (FAC) në OS (31). Duke përdorur OS herbivore për të trajtuar plagët standarde të shpimit, trajtimi i simuluar i herbivorëve tregoi gjithashtu një trend të ngjashëm. Kjo procedurë e standardizuar për simulimin e përgjigjes së bimëve ndaj sulmeve herbivore eliminon faktorët ngatërrues të shkaktuar nga ndryshimet në sjelljen e të ngrënit të herbivorëve, të cilat çojnë në shkallë të ndryshme dëmtimi në kohë të ndryshme (34). FAC, i cili dihet të jetë shkaku kryesor i OSM, zvogëlon JAS dhe përgjigjet e tjera të hormoneve të bimëve në OSS1, ndërsa OSS1 i zvogëlon qindra herë (31). Megjithatë, OSS1 shkaktoi nivele të ngjashme të akumulimit të JA krahasuar me OSM. Më parë është demonstruar se përgjigja e JA në Nepenthes të dobësuar është shumë e ndjeshme ndaj OSM, ku FAC mund të ruajë aktivitetin e tij edhe nëse hollohet 1:1000 me ujë (44). Prandaj, krahasuar me OSM, megjithëse FAC në OSS1 është shumë i ulët, është i mjaftueshëm për të shkaktuar shpërthim të mjaftueshëm të JA. Studimet e mëparshme kanë treguar se proteinat e ngjashme me porinën (45) dhe oligosakaridet (46) mund të përdoren si të dhëna molekulare për të shkaktuar përgjigje mbrojtëse të bimëve në OSS1. Megjithatë, është ende e paqartë nëse këta nxitës në OSS1 janë përgjegjës për akumulimin e JA-së të vërejtur në studimin aktual.
Edhe pse ka pak studime që përshkruajnë gjurmët diferenciale metabolike të shkaktuara nga aplikimi i barngrënësve të ndryshëm ose JA ose SA ekzogjene (acid salicilik) (47), askush nuk e ka shqetësuar shqetësimin specifik të specieve barngrënëse në rrjetin e barit të bimëve dhe efektet e tij në informacionin specifik personal. Ndikimi i përgjithshëm i metabolizmit studiohet në mënyrë sistematike. Kjo analizë konfirmoi më tej se lidhja e rrjetit të brendshëm të hormoneve me hormone të tjera bimore përveç JA-ve formon specifikën e riorganizimit metabolik të shkaktuar nga barngrënësit. Në veçanti, ne zbuluam se ET e shkaktuar nga OSM ishte dukshëm më e madhe se ajo e shkaktuar nga OSS1. Kjo mënyrë është në përputhje me më shumë përmbajtje FAC në OSM, e cila është një kusht i nevojshëm dhe i mjaftueshëm për të shkaktuar një shpërthim ET (48). Në kontekstin e ndërveprimit midis bimëve dhe barngrënësve, funksioni i sinjalizimit të ET në dinamikën e metabolitëve specifikë të bimëve është ende sporadik dhe synon vetëm një grup të vetëm përbërësish. Përveç kësaj, shumica e studimeve kanë përdorur aplikimin ekzogjen të ET-së ose pararendësve të saj ose frenuesve të ndryshëm për të studiuar rregullimin e ET-së, ndër të cilët këto aplikime kimike ekzogjene do të prodhojnë shumë efekte anësore jo-specifike. Sipas njohurive tona, ky studim përfaqëson shqyrtimin e parë sistematik në shkallë të gjerë të rolit të ET-së në përdorimin e ET-së për të prodhuar dhe perceptuar bimë transgjenike të dëmtuara për të koordinuar dinamikën e metabolomit të bimëve. Induksioni i ET-së specifike për herbivorët në fund të fundit mund të modulojë përgjigjen e metabolomit. Më i rëndësishmi është manipulimi transgjenik i gjeneve të biosintezës së ET-së (ACO) dhe perceptimit (ETR1) që zbuluan akumulimin de novo të fenolamideve specifike për herbivorët. Më parë është treguar se ET mund të rregullojë imët akumulimin e nikotinës të shkaktuar nga JA duke rregulluar putrescine N-metiltransferazën (49). Megjithatë, nga një këndvështrim mekanik, nuk është e qartë se si ET rregullon imët induksionin e fenamidit. Përveç funksionit të transduksionit të sinjalit të ET, fluksi metabolik mund të devijohet edhe në S-adenosil-1-metioninë për të rregulluar investimin në amidet e poliaminofenolit. S-adenosil-1-metionina është ET dhe ndërmjetës i zakonshëm i rrugës biosintetike të poliaminës. Mekanizmi me të cilin sinjali i ET rregullon nivelin e fenolamides ka nevojë për studim të mëtejshëm.
Për një kohë të gjatë, për shkak të numrit të madh të metabolitëve të veçantë me strukturë të panjohur, vëmendja intensive ndaj kategorive specifike metabolike nuk ka qenë në gjendje të vlerësojë në mënyrë strikte ndryshimet kohore të diversitetit metabolik pas ndërveprimeve biologjike. Aktualisht, bazuar në analizën e teorisë së informacionit, rezultati kryesor i përvetësimit të spektrit MS/MS bazuar në metabolitë të paanshëm është se barngrënësit që hanë ose simulojnë barngrënësit vazhdojnë të zvogëlojnë diversitetin e përgjithshëm metabolik të metabolomës së gjetheve, duke rritur shkallën e specializimit të tij. Kjo rritje e përkohshme në specifikën e metabolomës së shkaktuar nga barngrënësit shoqërohet me një rritje sinergjike në specifikën e transkriptomës. Karakteristika që kontribuon më shumë në këtë specializim më të madh të metabolomës (që ka një vlerë më të lartë Si) është metaboliti i veçantë me funksionin barngrënës të karakterizuar më parë. Ky model është në përputhje me parashikimin e teorisë OD, por parashikimi i MT në lidhje me rastësinë e riprogramimit të metabolomës nuk është i qëndrueshëm. Megjithatë, këto të dhëna janë gjithashtu në përputhje me parashikimin e modelit të përzier (MT më i mirë; Figura 1B), sepse metabolitët e tjerë të pakarakterizuar me funksione mbrojtëse të panjohura mund të ndjekin ende një shpërndarje të rastësishme të Si.
Një model i rëndësishëm i kapur më tej nga ky hulumtim është se nga niveli i mikro-evolucionit (një bimë e vetme dhe popullata e duhanit) në një shkallë më të madhe evolucionare (specie të duhanit të lidhura ngushtë), nivele të ndryshme të organizimit evolucionar janë në "mbrojtjen më të mirë". Ka dallime të konsiderueshme në aftësitë e barngrënësve. Moore et al. (20) dhe Kessler dhe Kalske (1) propozuan në mënyrë të pavarur të shndërrojnë tre nivelet funksionale të biodiversitetit të dalluara fillimisht nga Whittaker (50) në ndryshimet konstitutive dhe të induktuara kohore të diversitetit kimik; këta autorë nuk i përmblodhën asnjëra prej tyre. Procedurat për mbledhjen e të dhënave të metabolomit në shkallë të gjerë gjithashtu nuk përshkruajnë se si të llogaritet diversiteti metabolik nga këto të dhëna. Në këtë studim, rregullime të vogla në klasifikimin funksional të Whittaker do të marrin në konsideratë diversitetin α-metabolik si diversitetin e spektrave MS/MS në një bimë të caktuar, dhe diversitetin β-metabolik si metabolizmin bazë intraspecifik të një grupi popullatash. Hapësira, dhe diversiteti γ-metabolik do të jenë një zgjatim i analizës së specieve të ngjashme.
Sinjali JA është thelbësor për një gamë të gjerë të përgjigjeve metabolike të barngrënësve. Megjithatë, mungon një testim sasior rigoroz i kontributit të rregullimit intraspecifik të biosintezës së JA në diversitetin e metabolomit, dhe nëse sinjali JA është një vend i përgjithshëm për diversifikimin metabolik të shkaktuar nga stresi në një shkallë më të lartë makroevolucionare është ende e paqartë. Ne vumë re se natyra barngrënëse e barngrënësve Nepenthes shkakton specializim të metabolomit dhe ndryshimi i specializimit të metabolomit brenda popullatës së specieve Nicotiana dhe midis specieve të lidhura ngushtë Nicotiana është sistematikisht i korreluar pozitivisht me sinjalizimin JA. Përveç kësaj, kur sinjali JA është i dëmtuar, specifikimi metabolik i shkaktuar nga një barngrënës me një gjenotip të vetëm do të anulohet (Figura 3, C dhe E). Meqenëse ndryshimet e spektrit metabolik të popullatave të Nepenthes të dobësuara natyrshëm janë kryesisht sasiore, ndryshimet në diversitetin dhe specifikimin metabolik β në këtë analizë mund të shkaktohen kryesisht nga ngacmimi i fortë i kategorive të përbërjeve të pasura me metabolitë. Këto klasa përbërjesh dominojnë një pjesë të profilit të metabolomit dhe çojnë në një korrelacion pozitiv me sinjalet JA.
Meqenëse mekanizmat biokimikë të specieve të duhanit të lidhura ngushtë me të janë shumë të ndryshëm, metabolitët identifikohen posaçërisht në aspektin cilësor, kështu që është më analitik. Përpunimi i profilit metabolik të kapur nga teoria e informacionit zbulon se induksioni herbivor përkeqëson kompromisin midis diversitetit gama metabolik dhe specializimit. Sinjali JA luan një rol qendror në këtë kompromis. Rritja e specializimit të metabolomes është në përputhje me parashikimin kryesor OD dhe është i korreluar pozitivisht me sinjalin JA, ndërsa sinjali JA është i korreluar negativisht me diversitetin gama metabolik. Këto modele tregojnë se kapaciteti OD i bimëve përcaktohet kryesisht nga plasticiteti i JA, qoftë në një shkallë mikroevolucionare apo në një shkallë më të madhe evolucionare. Eksperimentet e aplikimit të JA ekzogjene që anashkalojnë defektet e biosintezës së JA zbulojnë më tej se speciet e duhanit të lidhura ngushtë mund të dallohen në specie që i përgjigjen sinjalit dhe jo-reaguese ndaj sinjalit, ashtu si mënyra e tyre e JA dhe plasticiteti i metabolomes i induktuar nga herbivorët. Speciet që nuk i përgjigjen sinjalit nuk mund të përgjigjen për shkak të pamundësisë së tyre për të prodhuar JA endogjene dhe për këtë arsye i nënshtrohen kufizimeve fiziologjike. Kjo mund të shkaktohet nga mutacionet në disa gjene kyçe në rrugën e sinjalizimit JA (AOS dhe JAR4 në N. crescens). Ky rezultat thekson se këto modele makroevolucionare ndërspecie mund të nxiten kryesisht nga ndryshimet në perceptimin dhe reagimin e brendshëm të hormoneve.
Përveç ndërveprimit midis bimëve dhe barngrënësve, eksplorimi i diversitetit metabolik lidhet me të gjitha përparimet e rëndësishme teorike në kërkimin e përshtatjes biologjike ndaj mjedisit dhe evolucionin e tipareve komplekse fenotipike. Me rritjen e sasisë së të dhënave të fituara nga instrumentet moderne MS, testimi i hipotezave mbi diversitetin metabolik tani mund të kapërcejë ndryshimet individuale/kategorike të metabolitëve dhe të kryejë analiza globale për të zbuluar modele të papritura. Në procesin e analizës në shkallë të gjerë, një metaforë e rëndësishme është ideja e konceptimit të hartave kuptimplote që mund të përdoren për të eksploruar të dhënat. Prandaj, një rezultat i rëndësishëm i kombinimit aktual të metabolomikës së paanshme MS/MS dhe teorisë së informacionit është se ai ofron një metrikë të thjeshtë që mund të përdoret për të ndërtuar harta për të shfletuar diversitetin metabolik në shkallë të ndryshme taksonomike. Është kërkesa themelore e kësaj metode. Studimi i evolucionit mikro/makro dhe ekologjisë së komunitetit.
Në nivelin makro-evolucionar, thelbi i teorisë së bashkë-evolucionit bimë-insekt të Ehrlich dhe Raven (51) është të parashikojë se ndryshimi i diversitetit metabolik ndërspecie është shkaku i diversifikimit të linjave të bimëve. Megjithatë, në pesëdhjetë vitet që nga botimi i kësaj pune themelore, kjo hipotezë është testuar rrallë (52). Kjo është kryesisht për shkak të karakteristikave filogjenetike të karakteristikave metabolike të krahasueshme në linjat e bimëve në distanca të gjata. Rrallësia mund të përdoret për të ankoruar metodat e analizës së synuar. Fluksi aktual i punës MS/MS i përpunuar nga teoria e informacionit përcakton sasinë e ngjashmërisë strukturore MS/MS të metabolitëve të panjohur (pa përzgjedhje paraprake të metabolitëve) dhe i konverton këto MS/MS në një grup MS/MS, kështu në metabolizmin profesional Këto modele makro-evolucionare krahasohen në shkallë klasifikimi. Tregues të thjeshtë statistikorë. Procesi është i ngjashëm me analizën filogjenetike, e cila mund të përdorë shtrirjen e sekuencave për të përcaktuar sasinë e shkallës së diversifikimit ose evolucionit të karakterit pa parashikim paraprak.
Në nivelin biokimik, hipoteza e shqyrtimit të Firn dhe Jones (53) tregon se diversiteti metabolik mbahet në nivele të ndryshme për të siguruar lëndë të para për të ushtruar aktivitetet biologjike të metabolitëve të palidhur më parë ose të zëvendësuar. Metodat e teorisë së informacionit ofrojnë një kornizë në të cilën këto tranzicione evolucionare specifike për metabolitët që ndodhin gjatë specializimit të metabolitëve mund të përcaktohen si pjesë e procesit të propozuar të shqyrtimit evolucionar: adaptim biologjikisht aktiv nga specifikë e ulët në specifikë të lartë. Metabolitë e frenuar të një mjedisi të caktuar.
Në përgjithësi, në ditët e para të biologjisë molekulare, u zhvilluan teori të rëndësishme të mbrojtjes së bimëve, dhe metodat e bazuara në hipoteza deduktive konsiderohen gjerësisht si mjeti i vetëm i përparimit shkencor. Kjo kryesisht për shkak të kufizimeve teknike të matjes së të gjithë metabolomit. Megjithëse metodat e bazuara në hipoteza janë veçanërisht të dobishme në zgjedhjen e mekanizmave të tjerë shkakësorë, aftësia e tyre për të çuar përpara kuptimin tonë të rrjeteve biokimike është më e kufizuar sesa metodat llogaritëse që janë aktualisht të disponueshme në shkencën bashkëkohore me të dhëna intensive. Prandaj, teoritë që nuk mund të parashikohen janë shumë përtej fushëveprimit të të dhënave të disponueshme, kështu që cikli hipotetik i formulës/testit të progresit në fushën e kërkimit nuk mund të shfuqizohet (4). Ne parashikojmë që rrjedha e punës llogaritëse e metabolomikës e prezantuar këtu mund të ringjallë interesin në çështjet e fundit (si) dhe përfundimtare (pse) të diversitetit metabolik, dhe të kontribuojë në një epokë të re të shkencës së të dhënave të udhëhequra teorikisht. Epoka rishqyrtoi teoritë e rëndësishme që frymëzuan brezat e mëparshëm.
Ushqyerja e drejtpërdrejtë e barngrënësve kryhet duke rritur një larvë të dytë të fazës së parë ose një larvë Sl në një gjethe të vetme me ngjyrë të zbehtë të një bime të vetme që lulëzon, me 10 riprodhime bimore për bimë. Larvat e insekteve u kapën me kapëse dhe indi i mbetur i gjethes u mblodh 24 dhe 72 orë pas infeksionit dhe u ngrirë shpejt, dhe metabolitët u nxorën.
Simuloni trajtimin me barngrënës në një mënyrë shumë të sinkronizuar. Metoda është përdorimi i rrotave me model pëlhure për të shpuar tre rreshta me gjemba në secilën anë të brinjëve të mesme të tre gjetheve të zgjeruara plotësisht të bimës gjatë fazës së rritjes së kurorës së pëlhurës dhe menjëherë aplikoni Ms të holluar 1:5. Ose përdorni gishta me doreza për të futur S1 OS në plagën e shpuar. Mblidhni dhe përpunoni një gjethe siç përshkruhet më sipër. Përdorni metodën e përshkruar më parë për të nxjerrë metabolitët primarë dhe hormonet bimore (54).
Për aplikimet ekzogjene të JA-së, tre gjethet e bishtit të secilës prej gjashtë bimëve me lule trëndafili të secilës specie trajtohen me 20 μl pastë lanoline që përmban 150 μg MeJA (Lan + MeJA) dhe 20 μl lanolinë plus trajtim të plagëve (Lan + W), ose përdoren 20 μl lanolinë të pastër si kontroll. Gjethet u mblodhën 72 orë pas trajtimit, u ngrinë menjëherë në azot të lëngshëm dhe u ruajtën në -80°C deri në përdorim.
Në grupin tonë kërkimor janë identifikuar katër linja transgjenike JA dhe ET, përkatësisht irAOC (36), irCOI1 (55), irACO dhe sETR1 (48). irAOC tregoi një rënie të fortë në nivelet e JA dhe JA-Ile, ndërsa irCOI1 nuk ishte i ndjeshëm ndaj JA-ve. Krahasuar me EV, akumulimi i JA-Ile u rrit. Në mënyrë të ngjashme, irACO do të zvogëlojë prodhimin e ET, dhe krahasuar me EV, sETR1, i cili është i pandjeshëm ndaj ET, do të rrisë prodhimin e ET.
Një spektrometër lazer fotoakustik (sensor ET në kohë reale Sensor Sense ETD-300) përdoret për të kryer matjen e ET në mënyrë jo-invazive. Menjëherë pas trajtimit, gjysma e gjetheve u prenë dhe u transferuan në një shishe qelqi të mbyllur 4 ml, dhe hapësira e sipërme u la të grumbullohej brenda 5 orëve. Gjatë matjes, çdo shishe u shpëla me një rrjedhë prej 2 litrash/orë ajër të pastër për 8 minuta, e cila më parë kishte kaluar nëpër një katalizator të ofruar nga Sensor Sense për të hequr CO2 dhe ujin.
Të dhënat e mikroarray-t u botuan fillimisht në (35) dhe u ruajtën në Bazën e të Dhënave Gjithëpërfshirëse të Shprehjes së Gjeneve të Qendrës Kombëtare për Informacion Bioteknologjik (NCBI) (numri i hyrjes GSE30287). Të dhënat që korrespondojnë me gjethet e shkaktuara nga trajtimi me W + OSM dhe kontrolli i padëmtuar u nxorën për këtë studim. Intensiteti i papërpunuar është log2. Para analizës statistikore, niveli bazë u konvertua dhe u normalizua në percentilin e saj të 75-të duke përdorur paketën softuerike R.
Të dhënat origjinale të sekuencimit të ARN-së (RNA-seq) të specieve Nicotiana u morën nga Arkivat e Leximit të Shkurtër (SRA) të NCBI-së, numri i projektit është PRJNA301787, i cili u raportua nga Zhou et al. (39) dhe vazhdon siç përshkruhet në (56). Të dhënat e papërpunuara të përpunuara nga W + W, W + OSM dhe W + OSS1 që korrespondojnë me speciet Nicotiana u zgjodhën për analizë në këtë studim dhe u përpunuan në mënyrën e mëposhtme: Së pari, leximet e papërpunuara të ARN-së u konvertuan në formatin FASTQ. HISAT2 konverton FASTQ në SAM, dhe SAMtools konverton skedarët SAM në skedarë të renditur BAM. StringTie përdoret për të llogaritur shprehjen e gjeneve, dhe metoda e saj e shprehjes është se ka fragmente për mijë fragmente bazë për milion fragmente transkriptimi të sekuencuara.
Kolona kromatografike Acclaim (150 mm x 2.1 mm; madhësia e grimcave 2.2μm) e përdorur në analizë dhe kolona mbrojtëse 4 mm x 4 mm përbëhen nga i njëjti material. Gradienti binar i mëposhtëm përdoret në sistemin Dionex UltiMate 3000 Ultra High Performance Lëngshëm Kromatografik (UHPLC): 0 deri në 0.5 minuta, isokratik 90% A [ujë i deionizuar, 0.1% (v/v) acetonitril dhe 0.05% acid formik], 10% B (Acetonitril dhe 0.05% acid formik); 0.5 deri në 23.5 minuta, faza gradient është përkatësisht 10% A dhe 90% B; 23.5 deri në 25 minuta, isokratik 10% A dhe 90% B. Shkalla e rrjedhjes është 400μl/min. Për të gjitha analizat MS, injektoni eluentin e kolonës në një analizues kuadrupoli dhe me kohë fluturimi (qTOF) të pajisur me një burim elektrospërkatjeje që vepron në modalitetin e jonizimit pozitiv (tensioni kapilar, 4500 V; dalja kapilare 130 V; temperatura e tharjes 200°C; rrjedha e ajrit të tharjes 10 litra/min).
Kryeni analizën e fragmenteve MS/MS (në tekstin e mëtejmë MS/MS) që është e parëndësishme ose e padallueshme nga të dhënat për të marrë informacion strukturor në lidhje me profilin e përgjithshëm metabolik të dallueshëm. Koncepti i metodës MS/MS pa dallim mbështetet në faktin se kuadrupoli ka një dritare shumë të madhe izolimi masiv [prandaj, merrni në konsideratë të gjitha sinjalet e raportit masë-ngarkesë (m/z) si fragmente]. Për këtë arsye, për shkak se instrumenti Impact II nuk ishte në gjendje të krijonte një pjerrësi CE, u kryen disa analiza të pavarura duke përdorur vlera të rritura të energjisë së përplasjes së disociimit të shkaktuar nga përplasja (CE). Shkurt, së pari analizoni mostrën me anë të jonizimit UHPLC-elektrospray/qTOF-MS duke përdorur modalitetin e spektrometrisë së vetme të masës (kushte të fragmentimit të ulët të gjeneruara nga fragmentimi në burim), duke skanuar nga m/z 50 në 1500 në një frekuencë përsëritjeje prej 5 Hz. Përdorni azotin si gaz përplasjeje për analizën MS/MS dhe kryeni matje të pavarura në katër tensionet e mëposhtme të ndryshme të disociimit të shkaktuar nga përplasja: 20, 30, 40 dhe 50 eV. Gjatë gjithë procesit të matjes, kuadrupoli ka dritaren më të madhe të izolimit të masës, nga m/z 50 në 1500. Kur eksperimenti i trupit të përparmë m/z dhe gjerësisë së izolimit është vendosur në 200, diapazoni i masës aktivizohet automatikisht nga softueri operativ i instrumentit dhe 0 Da. Skanoni për fragmente mase si në modalitetin e masës së vetme. Përdorni format natriumi (50 ml izopropanol, 200 μl acid formik dhe 1 ml tretësirë ​​ujore 1M NaOH) për kalibrimin e masës. Duke përdorur algoritmin e kalibrimit me precizion të lartë të Bruker, skedari i të dhënave kalibrohet pas ekzekutimit të spektrit mesatar në një periudhë të caktuar kohore. Përdorni funksionin e eksportit të softuerit Data Analysis v4.0 (Brook Dalton, Bremen, Gjermani) për të kthyer skedarët e të dhënave të papërpunuara në formatin NetCDF. Seti i të dhënave MS/MS është ruajtur në bazën e të dhënave të hapur të metabolomikës MetaboLights (www.ebi.ac.uk) me numrin e hyrjes. MTBLS1471.
Montimi MS/MS mund të realizohet nëpërmjet analizës së korrelacionit midis sinjaleve të cilësisë MS1 dhe MS/MS për energji të ulët dhe të lartë të përplasjes dhe rregulla të implementuara rishtazi. Skripti R përdoret për të realizuar analizën e korrelacionit të shpërndarjes së pararendësit në produkt, dhe skripti C# (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) përdoret për të implementuar rregullat.
Për të zvogëluar gabimet pozitive të rreme të shkaktuara nga zhurma në sfond dhe korrelacionin e rremë të shkaktuar nga zbulimi i disa karakteristikave m/z vetëm në disa mostra, ne përdorim funksionin "kulmi i mbushur" të paketës R. XCMS (për korrigjimin e zhurmës në sfond). Duhet të përdoret për të zëvendësuar intensitetin "NA" (kulmi i pazbuluar). Kur përdoret funksioni i kulmit të mbushur, ka ende shumë vlera intensiteti "0" në grupin e të dhënave që do të ndikojnë në llogaritjen e korrelacionit. Pastaj, krahasojmë rezultatet e përpunimit të të dhënave të marra kur përdoret funksioni i kulmit të mbushur dhe kur nuk përdoret funksioni i kulmit të mbushur, dhe llogarisim vlerën e zhurmës në sfond bazuar në vlerën mesatare të vlerësuar të korrigjuar, dhe më pas zëvendësojmë këto vlera të intensitetit 0 me vlerën e llogaritur të sfondit. Ne gjithashtu morëm në konsideratë vetëm karakteristikat, intensiteti i të cilave tejkalonte tre herë vlerën e sfondit dhe i konsideruam ato si "kulme të vërteta". Për llogaritjet PCC, merren në konsideratë vetëm sinjalet m/z të pararendësit të mostrës (MS1) dhe grupeve të të dhënave të fragmenteve me të paktën tetë maja të vërteta.
Nëse intensiteti i karakteristikës së cilësisë së pararendësit në të gjithë mostrën është i korreluar ndjeshëm me intensitetin e reduktuar të së njëjtës karakteristikë të cilësisë që i nënshtrohet energjisë së ulët ose të lartë të përplasjes, dhe karakteristika nuk është etiketuar si një kulm izotopik nga CAMERA, ajo mund të përcaktohet më tej. Pastaj, duke llogaritur të gjitha çiftet e mundshme pararendës-produkt brenda 3 s (dritarja e kohës së vlerësuar të mbajtjes për mbajtjen e kulmit), kryhet analiza e korrelacionit. Vetëm kur vlera m/z është më e ulët se vlera e pararendësit dhe fragmentimi MS/MS ndodh në të njëjtën vendndodhje të mostrës në grupin e të dhënave si pararendësi nga i cili është nxjerrë, ajo konsiderohet një fragment.
Bazuar në këto dy rregulla të thjeshta, ne përjashtojmë fragmentet e specifikuara me vlera m/z më të mëdha se m/z e pararendësit të identifikuar, dhe bazuar në pozicionin e mostrës ku shfaqet pararendësi dhe fragmenti i specifikuar. Është gjithashtu e mundur të zgjidhen karakteristikat e cilësisë së gjeneruara nga shumë fragmente në burim të gjeneruara në modalitetin MS1 ​​si pararendës kandidatë, duke gjeneruar kështu komponime të tepërta MS/MS. Për të zvogëluar këtë tepricë të të dhënave, nëse ngjashmëria NDP e spektrave tejkalon 0.6, dhe ato i përkasin kromatogramit "grupi pc" të shënuar nga CAMERA, ne do t'i bashkojmë ato. Së fundmi, ne bashkojmë të katër rezultatet CE të shoqëruara me pararendësin dhe fragmentet në spektrin përfundimtar të përbërë të dekonvoluar duke zgjedhur majën më të lartë të intensitetit midis të gjitha majave kandidate me të njëjtën vlerë m/z në energji të ndryshme përplasjeje. Hapat pasues të përpunimit bazohen në konceptin e spektrit të përbërë dhe marrin parasysh kushtet e ndryshme CE të nevojshme për të maksimizuar probabilitetin e fragmentimit, sepse disa fragmente mund të zbulohen vetëm nën një energji specifike përplasjeje.
RDPI (30) u përdor për të llogaritur induktivitetin e profilit metabolik. Diversiteti i spektrit metabolik (indeksi Hj) rrjedh nga bollëku i pararendësve MS/MS duke përdorur entropinë Shannon të shpërndarjes së frekuencës MS/MS duke përdorur ekuacionin e mëposhtëm të përshkruar nga Martínez et al. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) ku Pij korrespondon me frekuencën relative të MS/MS të i-të në mostrën e j-të (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
Specifikiteti metabolik (indeksi Si) përcaktohet si identiteti i shprehjes së një MS/MS të caktuar në lidhje me frekuencën midis mostrave që merren në konsideratë. Specifikiteti MS/MS llogaritet si Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Përdorni formulën e mëposhtme për të matur indeksin δj specifik të metabolomit të secilës mostër j, dhe mesataren e specifikës MS/MS δj = ∑i = 1mPijSi
Spektrat MS/MS janë të rreshtuar në çifte dhe ngjashmëria llogaritet bazuar në dy rezultatet. Së pari, duke përdorur NDP standarde (e njohur edhe si metoda e korrelacionit kosinus), përdorni ekuacionin e mëposhtëm për të vlerësuar ngjashmërinë segmentale midis spektrave NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 ku S1 dhe S2 Përkatësisht, për spektrin 1 dhe spektrin 2, si dhe WS1, i dhe WS2, i përfaqëson peshën bazuar në intensitetin e kulmit ku diferenca e kulmit të i-të të përbashkët midis dy spektrave është më pak se 0.01 Da. Pesha llogaritet si më poshtë: W = [intensiteti i kulmit] m [cilësia] n, m = 0.5, n = 2, siç sugjerohet nga MassBank.
U zbatua një metodë e dytë vlerësimi, e cila përfshinte analizimin e NL-së së përbashkët midis MS/MS. Për këtë qëllim, ne përdorëm 52 listat NL që hasen shpesh gjatë procesit të fragmentimit të MS në të njëjtën kohë, dhe NL-në më specifike (skedari i të dhënave S1) që është shënuar më parë për spektrin MS/MS të metabolitëve sekondarë të specieve të dobësuara Nepenthes (9, 26). Krijoni një vektor binar prej 1 dhe 0 për secilën MS/MS, që korrespondon me aktualen dhe joekzistencën e disa NL-ve përkatësisht. Bazuar në ngjashmërinë e distancës Euklidiane, rezultati i ngjashmërisë NL llogaritet për secilën palë vektorësh binarë NL.
Për të kryer grupim të dyfishtë, përdorëm paketën R DiffCoEx, e cila bazohet në një zgjerim të Analizës së Bashkëshprehjes së Gjenit të Ponderuar (WGCNA). Duke përdorur matricat e pikëzimit NDP dhe NL të spektrave MS/MS, përdorëm DiffCoEx për të llogaritur matricën krahasuese të korrelacionit. Grupimi binar kryhet duke vendosur parametrin "cutreeDynamic" në method = "hybrid", cutHeight = 0.9999, deepSplit = T dhe minClusterSize = 10. Kodi burimor R i DiffCoEx u shkarkua nga skedari shtesë 1 nga Tesson et al. (57); Paketa e kërkuar e softuerit R WGCNA mund të gjendet në https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Për të kryer analizën e rrjetit molekular MS/MS, ne llogaritëm lidhshmërinë spektrale të çiftëzuar bazuar në llojet e ngjashmërisë NDP dhe NL, dhe përdorëm softuerin Cytoscape për të vizualizuar topologjinë e rrjetit duke përdorur paraqitjen organike në aplikacionin e zgjerimit të algoritmit të paraqitjes CyFilescape yFiles.
Përdorni versionin R 3.0.1 për të kryer analiza statistikore mbi të dhënat. Rëndësia statistikore u vlerësua duke përdorur analizën dypalëshe të variancës (ANOVA), e ndjekur nga testi post-hoc i ndryshimit të ndershëm domethënës të Tukey-t (HSD). Për të analizuar ndryshimin midis trajtimit barngrënës dhe kontrollit, shpërndarja dypalëshe e dy grupeve të mostrave me të njëjtën variancë u analizua duke përdorur testin t të Student-it.
Për materiale shtesë për këtë artikull, ju lutemi shihni http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Ky është një artikull me akses të hapur i shpërndarë sipas kushteve të Licencës Creative Commons Attribution-Jo-Commercial, e cila lejon përdorimin, shpërndarjen dhe riprodhimin në çdo medium, për sa kohë që përdorimi përfundimtar nuk është për përfitim komercial dhe kushti kryesor është që vepra origjinale të jetë e saktë. Referencë.
Shënim: Ne ju kërkojmë vetëm të jepni adresën tuaj të email-it në mënyrë që personi që ju rekomandoni në faqe të dijë se ju dëshironi që ai ta shohë email-in dhe se nuk është spam. Ne nuk do të kapim asnjë adresë email-i.
Kjo pyetje përdoret për të testuar nëse jeni vizitor dhe për të parandaluar dërgimin automatik të spam-it.
Teoria e informacionit ofron një monedhë universale për krahasimin e metabolomeve të veçanta dhe parashikimin e teorive të mbrojtjes nga testet.
Teoria e informacionit ofron një monedhë universale për krahasimin e metabolomeve të veçanta dhe parashikimin e teorive të mbrojtjes nga testet.
©2021 Shoqata Amerikane për Avancimin e Shkencës. të gjitha të drejtat e rezervuara. AAAS është partner i HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dhe COUNTER. Shkenca përparon ISSN 2375-2548.