Artikulli është pjesë e temës kërkimore "Përmirësimi i rezistencës së bishtajoreve ndaj patogjenëve dhe dëmtuesve", shikoni të 5 artikujt
Agjenti shkaktar i sëmundjes kërpudhore të bimëve Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary përdor një strategji shumështresore për të infektuar bimë të ndryshme pritëse. Ky studim propozon përdorimin e diaminës L-ornitinë, një aminoacid jo-proteinik që stimulon sintezën e aminoacideve të tjera esenciale, si një strategji alternative menaxhimi për të rritur përgjigjet molekulare, fiziologjike dhe biokimike të Phaseolus vulgaris L. ndaj mykut të bardhë të shkaktuar nga Pseudomonas sclerotiorum. Eksperimentet in vitro treguan se L-ornitina pengoi ndjeshëm rritjen miceliale të S. pyrenoidosa në një mënyrë të varur nga doza. Për më tepër, ajo mund të zvogëlojë ndjeshëm ashpërsinë e mykut të bardhë në kushtet e serrës. Për më tepër, L-ornitina stimuloi rritjen e bimëve të trajtuara, duke treguar se përqendrimet e testuara të L-ornitinës nuk ishin fitotoksike për bimët e trajtuara. Përveç kësaj, L-ornitina rriti shprehjen e antioksidantëve jo-enzimatikë (fenolikë dhe flavonoidë totalë të tretshëm) dhe antioksidantëve enzimatikë (katalaza (CAT), peroksidaza (POX) dhe polifenol oksidaza (PPO)), dhe rriti shprehjen e tre gjeneve të lidhura me antioksidantët (PvCAT1, PvSOD dhe PvGR). Për më tepër, analiza in silico zbuloi praninë e një proteine ​​të supozuar oksaloacetat acetilhidrolazë (SsOAH) në gjenomën e S. sclerotiorum, e cila ishte shumë e ngjashme me proteinat oksaloacetat acetilhidrolazë (SsOAH) të Aspergillus fijiensis (AfOAH) dhe Penicillium sp. (PlOAH) për sa i përket analizës funksionale, domeneve të konservuara dhe topologjisë. Është interesante se shtimi i L-ornitinës në mediumin e lëngut të dekstrozës së patates (PDB) uli ndjeshëm shprehjen e gjenit SsOAH në micelinë e S. sclerotiorum. Në mënyrë të ngjashme, aplikimi ekzogjen i L-ornitinës uli ndjeshëm shprehjen e gjenit SsOAH në micelet kërpudhore të mbledhura nga bimët e trajtuara. Së fundmi, aplikimi i L-ornitinës uli ndjeshëm sekretimin e acidit oksalik si në mjedisin PDB ashtu edhe në gjethet e infektuara. Si përfundim, L-ornitina luan një rol kyç në ruajtjen e statusit redoks, si dhe në rritjen e përgjigjes mbrojtëse të bimëve të infektuara. Rezultatet e këtij studimi mund të ndihmojnë në zhvillimin e metodave inovative dhe miqësore me mjedisin për të kontrolluar mykun e bardhë dhe për të zbutur ndikimin e tij në prodhimin e fasuleve dhe kulturave të tjera.
Myku i bardhë, i shkaktuar nga kërpudha nekrotrofike Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, është një sëmundje shkatërruese që ul rendimentin dhe që përbën një kërcënim serioz për prodhimin global të fasules (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum është një nga patogjenët kërpudhorë të bimëve që përhapen në tokë më të vështirë për t'u kontrolluar, me një gamë të gjerë pritësish prej mbi 600 speciesh bimore dhe aftësinë për të tretur shpejt indet pritëse në një mënyrë jo specifike (Liang dhe Rollins, 2018). Në kushte të pafavorshme, ai kalon një fazë kritike të ciklit të tij jetësor, duke mbetur në gjendje gjumi për periudha të gjata kohore si struktura të zeza, të forta, të ngjashme me farë të quajtura 'sklerotia' në tokë ose si rritje të bardha, të buta në miceli ose në palcën e kërcellit të bimëve të infektuara (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum është i aftë të formojë skleroti, gjë që i lejon atij të mbijetojë në fushat e infektuara për periudha të gjata kohore dhe të vazhdojë gjatë sëmundjes (Schwartz et al., 2005). Sklerotiet janë të pasura me lëndë ushqyese, mund të vazhdojnë në tokë për periudha të gjata dhe shërbejnë si inokulumi kryesor për infeksionet pasuese (Schwartz et al., 2005). Në kushte të favorshme, sklerotiet mbijnë dhe prodhojnë spore ajrore që mund të infektojnë të gjitha pjesët mbi tokë të bimës, duke përfshirë, por pa u kufizuar në lule, kërcell ose bishtaja (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum përdor një strategji shumë-shtresore për të infektuar bimët e saj pritëse, duke përfshirë një seri ngjarjesh të koordinuara nga mbirja sklerotiale deri te zhvillimi i simptomave. Fillimisht, S. sclerotiorum prodhon spore të pezulluara (të quajtura askospore) nga struktura të ngjashme me kërpudhat të quajtura apothecie, të cilat përhapen në ajër dhe zhvillohen në skleroti jo-lëvizëse në mbeturinat e bimëve të infektuara (Bolton et al., 2006). Kërpudha më pas sekreton acid oksalik, një faktor virulence, për të kontrolluar pH-in e murit qelizor të bimës, për të nxitur degradimin enzimatik dhe pushtimin e indeve (Hegedus dhe Rimmer, 2005), dhe për të shtypur shpërthimin oksidativ të bimës pritëse. Ky proces acidifikimi dobëson murin qelizor të bimës, duke siguruar një mjedis të favorshëm për funksionimin normal dhe efikas të enzimave që degradojnë murin qelizor të kërpudhave (CWDE), duke i lejuar patogjenit të kapërcejë barrierën fizike dhe të depërtojë në indet pritëse (Marciano et al., 1983). Pasi depërton, S. sclerotiorum sekreton një numër të CWDE-ve, të tilla si poligalakturonaza dhe celulaza, të cilat lehtësojnë përhapjen e tij në indet e infektuara dhe shkaktojnë nekrozë indesh. Përparimi i lezioneve dhe i shtresave hifale çon në simptomat karakteristike të mykut të bardhë (Hegedus dhe Rimmer, 2005). Ndërkohë, bimët pritëse njohin modelet molekulare të shoqëruara me patogjenët (PAMP) përmes receptorëve të njohjes së modeleve (PRR), duke shkaktuar një seri ngjarjesh sinjalizuese që në fund të fundit aktivizojnë përgjigjet mbrojtëse.
Pavarësisht dekadave të përpjekjeve për kontrollin e sëmundjeve, mungesa e plazmës rezistente të mjaftueshme mbetet në fasule, si në kulturat e tjera komerciale, për shkak të rezistencës, mbijetesës dhe përshtatshmërisë së patogjenit. Prandaj, menaxhimi i sëmundjeve është jashtëzakonisht sfidues dhe kërkon një strategji të integruar dhe shumëplanëshe që përfshin një kombinim të praktikave kulturore, kontrollit biologjik dhe fungicideve kimike (O'Sullivan et al., 2021). Kontrolli kimik i mykut të bardhë është më efektivi sepse fungicidet, kur aplikohen saktë dhe në kohën e duhur, mund të kontrollojnë në mënyrë efektive përhapjen e sëmundjes, të zvogëlojnë ashpërsinë e infeksionit dhe të minimizojnë humbjet e rendimentit. Megjithatë, përdorimi i tepërt dhe mbështetja e tepërt te fungicidet mund të çojë në shfaqjen e llojeve rezistente të S. sclerotiorum dhe të ndikojë negativisht në organizmat jo-shënjestër, shëndetin e tokës dhe cilësinë e ujit (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Prandaj, gjetja e alternativave miqësore me mjedisin është bërë një përparësi kryesore.
Poliaminat (PA), të tilla si putrescina, spermidina, spermina dhe kadaverina, mund të shërbejnë si alternativa premtuese kundër patogjenëve të bimëve që përhapen në tokë, duke zvogëluar kështu plotësisht ose pjesërisht përdorimin e fungicideve kimike të rrezikshme (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Në bimët e larta, PA-të janë të përfshira në shumë procese fiziologjike duke përfshirë, por pa u kufizuar në, ndarjen qelizore, diferencimin dhe përgjigjen ndaj streseve abiotike dhe biotike (Kiliny dhe Nehela, 2020). Ato mund të veprojnë si antioksidantë, të ndihmojnë në pastrimin e specieve reaktive të oksigjenit (ROS), të ruajnë homeostazën redoks (Nehela dhe Killiny, 2023), të induktojnë gjene të lidhura me mbrojtjen (Romero et al., 2018), të rregullojnë rrugë të ndryshme metabolike (Nehela dhe Killiny, 2023), të modulojnë fitohormonet endogjene (Nehela dhe Killiny, 2019), të krijojnë rezistencë sistemike të fituar (SAR) dhe të rregullojnë ndërveprimet bimë-patogjen (Nehela dhe Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Vlen të përmendet se mekanizmat dhe rolet specifike të PA-ve në mbrojtjen e bimëve ndryshojnë në varësi të specieve bimore, patogjenëve dhe kushteve mjedisore. PA-ja më e bollshme në bimë biosintetizohet nga poliamina thelbësore L-ornitina (Kiliny dhe Nehela, 2020).
L-ornitina luan role të shumëfishta në rritjen dhe zhvillimin e bimëve. Për shembull, studimet e mëparshme kanë treguar se në oriz (Oryza sativa), ornitina mund të shoqërohet me riciklimin e azotit (Liu et al., 2018), rendimentin, cilësinë dhe aromën e orizit (Lu et al., 2020) dhe përgjigjen ndaj stresit të ujit (Yang et al., 2000). Për më tepër, aplikimi ekzogjen i L-ornitinës rriti ndjeshëm tolerancën ndaj thatësirës në panxhar sheqeri (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) dhe lehtësoi stresin e kripës në bimët e qepës (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu dhe Çavuşoǧlu, 2021) dhe kajusë (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). Roli i mundshëm i L-ornitinës në mbrojtjen nga stresi abiotik mund të jetë për shkak të përfshirjes së saj në akumulimin e prolinës në bimët e trajtuara. Për shembull, gjenet që lidhen me metabolizmin e prolinës, siç janë gjenet e ornitinës delta aminotransferazës (delta-OAT) dhe prolin dehidrogjenazës (ProDH1 dhe ProDH2), janë raportuar më parë se janë të përfshira në mbrojtjen e Nicotiana benthamiana dhe Arabidopsis thaliana kundër llojeve të Pseudomonas syringae jo-pritës (Senthil-Kumar dhe Mysore, 2012). Nga ana tjetër, dekarboksilaza e ornitinës kërpudhore (ODC) është e nevojshme për rritjen e patogjenëve (Singh et al., 2020). Synimi i ODC-së së Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici nëpërmjet heshtjes së gjeneve të induktuara nga pritësi (HIGS) rriti ndjeshëm rezistencën e bimëve të domates ndaj vyshkjes së Fusarium (Singh et al., 2020). Megjithatë, roli i mundshëm i aplikimit ekzogjen të ornitinës kundër streseve biotike siç janë fitopatogjenët nuk është studiuar mirë. Më e rëndësishmja, efektet e ornitinës në rezistencën ndaj sëmundjeve dhe fenomenet biokimike dhe fiziologjike që lidhen me to mbeten kryesisht të paeksploruara.
Të kuptuarit e kompleksitetit të infeksionit të bishtajoreve me S. sclerotiorum është e rëndësishme për zhvillimin e strategjive efektive të kontrollit. Në këtë studim, ne synuam të identifikonim rolin e mundshëm të diaminës L-ornitinë si një faktor kyç në përmirësimin e mekanizmave mbrojtës dhe rezistencës së bimëve bishtajore ndaj infeksionit Sclerotinia sclerotiorum. Ne hipotetizojmë se, përveç përmirësimit të përgjigjeve mbrojtëse të bimëve të infektuara, L-ornitina luan gjithashtu një rol kyç në ruajtjen e statusit redoks. Ne propozojmë që efektet e mundshme të L-ornitinës lidhen me rregullimin e mekanizmave mbrojtës antioksidues enzimatikë dhe jo-enzimatikë dhe ndërhyrjen në faktorët e patogjenitetit/virulencës fungale dhe proteinat e shoqëruara. Ky funksionalitet i dyfishtë i L-ornitinës e bën atë një kandidat premtues për një strategji të qëndrueshme për të zbutur ndikimin e mykut të bardhë dhe për të rritur rezistencën e kulturave të zakonshme të bishtajoreve ndaj këtij patogjeni të fuqishëm fungal. Rezultatet e studimit të tanishëm mund të ndihmojnë në zhvillimin e metodave inovative dhe miqësore me mjedisin për të kontrolluar mykun e bardhë dhe për të zbutur ndikimin e tij në prodhimin e bishtajoreve.
Në këtë studim, një varietet komercial i ndjeshëm i fasules së zakonshme, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), u përdor si material eksperimental. Farat e shëndetshme u siguruan me mirësi nga Departamenti i Kërkimeve të Bishtajoreve, Instituti i Kërkimeve të Kulturave të Fushës (FCRI), Qendra e Kërkimeve Bujqësore (ARC), Egjipt. Pesë fara u mbjellën në vazo plastike (diametri i brendshëm 35 cm, thellësia 50 cm) të mbushura me tokë të infektuar nga S. sclerotiorum në kushte serre (25 ± 2 °C, lagështia relative 75 ± 1%, 8 orë dritë/16 orë errësirë). 7-10 ditë pas mbjelljes (DPS), fidanët u rralluan për të lënë vetëm dy fidanë me rritje uniforme dhe tre gjethe të zgjeruara plotësisht në secilën vazo. Të gjitha bimët në vazo u ujitën një herë në dy javë dhe u plehëruan çdo muaj me shkallën e rekomanduar për varietetin e dhënë.
Për të përgatitur një përqendrim prej 500 mg/L të L-ornitinëdiaminës (e njohur edhe si acid (+)-(S)-2,5-diaminopentanoik; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Gjermani), 50 mg u tretën fillimisht në 100 mL ujë të distiluar steril. Tretësira bazë u hollua më pas dhe u përdor në eksperimentet pasuese. Shkurtimisht, gjashtë seri përqendrimesh të L-ornitinës (12.5, 25, 50, 75, 100 dhe 125 mg/L) u testuan in vitro. Përveç kësaj, uji i distiluar steril u përdor si kontroll negativ (Mock) dhe pluhuri i lagështueshëm fungicid komercial "Rizolex-T" 50% (toklofos-metil 20% + tiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Guvernatori i Gharbisë, Egjipt) u përdor si kontroll pozitiv. Fungicidi komercial “Rizolex-T” u testua in vitro në pesë përqendrime (2, 4, 6, 8 dhe 10 mg/L).
Mostrat e kërcejve dhe bishtajave të fasules së zakonshme që tregonin simptoma tipike të mykut të bardhë (shkalla e infektimit: 10–30%) u mblodhën nga fermat komerciale. Edhe pse shumica e materialeve bimore të infektuara u identifikuan sipas specieve/varieteteve (varieteti komercial i ndjeshëm Giza 3), të tjerat, veçanërisht ato të marra nga tregjet lokale, ishin të specieve të panjohura. Materialet e infektuara të mbledhura u dezinfektuan fillimisht sipërfaqësisht me tretësirë ​​hipokloriti natriumi 0.5% për 3 minuta, pastaj u shpëlanë disa herë me ujë të distiluar steril dhe u thanë me letër filtri sterile për të hequr ujin e tepërt. Organet e infektuara u prenë më pas në copa të vogla nga indi i mesëm (midis indeve të shëndetshme dhe të infektuara), u kultivuan në mediumin e agarit të dekstrozës së patates (PDA) dhe u inkubuan në 25 ± 2 °C me një cikël 12 orësh dritë/12 orë errësirë ​​për 5 ditë për të stimuluar formimin e skleroteve. Metoda e majës miceliale u përdor gjithashtu për të pastruar izolatet kërpudhore nga kulturat e përziera ose të kontaminuara. Izolati i pastruar i kërpudhave u identifikua së pari bazuar në karakteristikat e tij morfologjike kulturore dhe më pas u konfirmua të ishte S. sclerotiorum bazuar në tiparet mikroskopike. Së fundmi, të gjitha izolatet e pastruara u testuan për patogjenitet në kultivarin e ndjeshëm të fasules së zakonshme Giza 3 për të përmbushur postulatet e Koch-ut.
Përveç kësaj, izolati më invaziv i S. sclerotiorum (izolati #3) u konfirmua më tej bazuar në sekuencimin e spacerit të transkriptuar të brendshëm (ITS) siç përshkruhet nga White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Shkurtimisht, izolatet u kultivuan në lëng dekstroze patateje (PDB) dhe u inkubuan në 25 ± 2 °C për 5-7 ditë. Miceli i kërpudhave u mblodh më pas, u filtrua përmes napës, u la dy herë me ujë steril dhe u tha me letër filtri sterile. ADN-ja gjenomike u izolua duke përdorur Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Rajoni i ADN-së r të ITS u amplifikua më pas duke përdorur çiftin specifik të prajmerëve ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; madhësia e pritur: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Produktet e pastruara të PCR u dorëzuan për sekuencim (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Sekuencat e ADN-së r të ITS u sekuencuan në mënyrë dypalëshe duke përdorur metodën e sekuencimit Sanger. Sekuencat e pyetjeve të mbledhura u krahasuan më pas me të dhënat më të fundit në GenBank dhe Qendrën Kombëtare për Informacion Bioteknologjik (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) duke përdorur softuerin BLASTn. Sekuenca e pyetjes u krahasua me 20 lloje/izolate të tjera të S. sclerotiorum të marra nga të dhënat më të fundit në NCBI GenBank (Tabela Plotësuese S1) duke përdorur ClustalW në Paketën e Analizës së Gjenetikës Molekulare Evolucionare (MEGA-11; versioni 11) (Kumar et al., 2024). Analiza evolucionare u krye duke përdorur metodën e gjasës maksimale dhe modelin e përgjithshëm të zëvendësimit të nukleotideve të kthyeshëm në kohë (Nei dhe Kumar, 2000). Tregohet pema me gjasën më të lartë logaritmike. Pema fillestare për kërkimin heuristik zgjidhet duke zgjedhur pemën me gjasën më të lartë logaritmike midis pemës së bashkimit të fqinjëve (NJ) (Kumar et al., 2024) dhe pemës së kursimit maksimal (MP). Pema NJ u ndërtua duke përdorur një matricë distancë çift të llogaritur duke përdorur modelin e përgjithshëm të kthyeshëm në kohë (Nei dhe Kumar, 2000).
Aktiviteti antibakterial i L-ornitinës dhe baktericideve "Rizolex-T" u përcaktua in vitro me metodën e difuzionit në agar. Metoda: Merrni sasinë e duhur të tretësirës bazë të L-ornitinës (500 mg/L) dhe përziejeni mirë me 10 ml të mjedisit ushqyes PDA për të përgatitur tretësira me përqendrime përfundimtare prej 12.5, 25, 50, 75, 100 dhe 125 mg/L, përkatësisht. Pesë përqendrime të fungicidit "Rizolex-T" (2, 4, 6, 8 dhe 10 mg/L) dhe ujë i distiluar steril u përdorën si kontroll. Pasi mjedisi u ngurtësua, një tapë miceliale e përgatitur fllad e kulturës Sclerotinia sclerotiorum, me diametër 4 mm, u transferua në qendër të enës Petri dhe u kultivua në 25±2°C derisa miceli mbuloi të gjithë enën Petri të kontrollit, pas së cilës u regjistrua rritja e kërpudhave. Llogaritni përqindjen e frenimit të rritjes radiale të S. sclerotiorum duke përdorur ekuacionin 1:
Eksperimenti u përsërit dy herë, me gjashtë replikime biologjike për secilin grup kontrolli/eksperimental dhe pesë vazo (dy bimë për vazo) për secilën replikim biologjik. Çdo replikim biologjik u analizua dy herë (dy replikime teknike) për të siguruar saktësinë, besueshmërinë dhe riprodhueshmërinë e rezultateve eksperimentale. Përveç kësaj, analiza e regresionit probit u përdor për të llogaritur përqendrimin frenues gjysmë-maksimal (IC50) dhe IC99 (Prentice, 1976).
Për të vlerësuar potencialin e L-ornitinës në kushte serre, u kryen dy eksperimente të njëpasnjëshme në vazo. Shkurtimisht, vazot u mbushën me tokë argjilore-rërore të sterilizuar (3:1) dhe u inokuluan me një kulturë të përgatitur fllad të S. sclerotiorum. Së pari, izolati më invaziv i S. sclerotiorum (izolati #3) u kultivua duke prerë një sklerotium përgjysmë, duke e vendosur me fytyrën poshtë në një PDA dhe duke e inkubuar në 25°C në errësirë ​​të vazhdueshme (24 orë) për 4 ditë për të stimuluar rritjen e micelit. Katër tapa agar me diametër 5 mm u morën më pas nga buza kryesore dhe u inokuluan me 100 g të një përzierjeje sterile të krundeve të grurit dhe orizit (1:1, v/v) dhe të gjitha balonat u inkubuan në 25 ± 2 °C nën një cikël 12 orësh dritë/12 orë errësirë ​​për 5 ditë për të stimuluar formimin e skleroteve. Përmbajtja e të gjitha balonave u përzie plotësisht për të siguruar homogjenitet para se të shtohej toka. Pastaj, në secilën vazo u shtuan 100 g të përzierjes kolonizuese të krundeve për të siguruar një përqendrim konstant të patogjenëve. Vazot e inokuluara u ujitën për të aktivizuar rritjen e kërpudhave dhe u vendosën në kushte serre për 7 ditë.
Pesë fara të varietetit Giza 3 u mbjellën më pas në secilën vazo. Për vazot e trajtuara me L-ornitinë dhe fungicidin Rizolex-T, farat e sterilizuara u zhytën fillimisht për dy orë në një tretësirë ​​ujore të dy përbërjeve me një përqendrim përfundimtar IC99 prej rreth 250 mg/L dhe 50 mg/L, përkatësisht, dhe më pas u thanë në ajër për një orë para mbjelljes. Nga ana tjetër, farat u zhytën në ujë të distiluar steril si kontroll negativ. Pas 10 ditësh, para ujitjes së parë, fidanët u rralluan, duke lënë vetëm dy fidanë të pastër në secilën vazo. Përveç kësaj, për të siguruar infeksionin me S. sclerotiorum, kërcejtë e bimëve të fasules në të njëjtën fazë zhvillimi (10 ditë) u prenë në dy vende të ndryshme duke përdorur një bisturi të sterilizuar dhe afërsisht 0.5 g të përzierjes kolonizuese të krundeve u vendosën në secilën plagë, e ndjekur nga lagështia e lartë për të stimuluar infeksionin dhe zhvillimin e sëmundjes në të gjitha bimët e inokuluara. Bimët e kontrollit u plagosën në mënyrë të ngjashme dhe një sasi e barabartë (0.5 g) e përzierjes sterile të krundeve të pakolonizuara u vendos në plagë dhe u mbajt nën lagështi të lartë për të simuluar mjedisin për zhvillimin e sëmundjes dhe për të siguruar qëndrueshmëri midis grupeve të trajtimit.
Metoda e trajtimit: Fidanët e fasules u ujitën me 500 ml të një tretësire ujore të L-ornitinës (250 mg/l) ose fungicidit Rizolex-T (50 mg/l) duke ujitur tokën, më pas trajtimi u përsërit tre herë me një interval prej 10 ditësh. Kontrollet e trajtuara me placebo u ujitën me 500 ml ujë të distiluar steril. Të gjitha trajtimet u kryen në kushte serre (25 ± 2°C, lagështi relative 75 ± 1% dhe një fotoperiod prej 8 orësh dritë/16 orë errësirë). Të gjitha vazot u ujitën çdo dy javë dhe u trajtuan çdo muaj me një pleh të balancuar NPK (20-20-20, me 3.6% squfur dhe mikroelemente TE; Zain Seeds, Egjipt) në një përqendrim prej 3-4 g/l me spërkatje gjethesh sipas rekomandimeve për varietetin specifik dhe udhëzimeve të prodhuesit. Nëse nuk përcaktohet ndryshe, gjethet e pjekura plotësisht të zgjeruara (gjetha e 2-të dhe e 3-të nga lart) u mblodhën nga secila replikat biologjike 72 orë pas trajtimit (hpt), u homogjenizuan, u bashkuan dhe u ruajtën në -80 °C për analiza të mëtejshme duke përfshirë, por pa u kufizuar në, lokalizimin histokimik in situ të treguesve të stresit oksidativ, peroksidimin e lipideve, antioksidantët enzimatikë dhe joenzimatikë dhe shprehjen e gjeneve.
Intensiteti i infeksionit nga myku i bardhë u vlerësua çdo javë 21 ditë pas inokulimit (dpi) duke përdorur një shkallë prej 1–9 (Tabela Plotësuese S2) bazuar në shkallën Petzoldt dhe Dickson (1996) të modifikuar nga Teran et al. (2006). Shkurtimisht, kërcejtë dhe degët e bimëve të fasules u ekzaminuan duke filluar nga pika e inokulimit për të ndjekur përparimin e lezioneve përgjatë internodave dhe nyjeve. Distanca e lezionit nga pika e inokulimit deri në pikën më të largët përgjatë kërcellit ose degës u mat më pas dhe u caktua një pikëzim prej 1–9 bazuar në vendndodhjen e lezionit, ku (1) tregonte mungesë infeksioni të dukshëm pranë pikës së inokulimit dhe (2–9) tregonte një rritje graduale të madhësisë së lezionit dhe përparim përgjatë nyjeve/internodave (Tabela Plotësuese S2). Intensiteti i infeksionit nga myku i bardhë u konvertua më pas në përqindje duke përdorur formulën 2:
Përveç kësaj, sipërfaqja nën kurbën e përparimit të sëmundjes (AUDPC) u llogarit duke përdorur formulën (Shaner dhe Finney, 1977), e cila u adaptua së fundmi për kalbjen e bardhë të fasules së zakonshme (Chauhan et al., 2020) duke përdorur ekuacionin 3:
Ku Yi = ashpërsia e sëmundjes në kohën ti, Yi+1 = ashpërsia e sëmundjes në kohën tjetër ti+1, ti = koha e matjes së parë (në ditë), ti+1 = koha e matjes tjetër (në ditë), n = numri total i pikave kohore ose pikave të vëzhgimit. Parametrat e rritjes së bimës së fasules, duke përfshirë lartësinë e bimës (cm), numrin e degëve për bimë dhe numrin e gjetheve për bimë, u regjistruan çdo javë për 21 ditë në të gjitha replikat biologjike.
Në çdo replikim biologjik, mostrat e gjetheve (gjethet e dyta dhe të treta të zhvilluara plotësisht nga maja) u mblodhën në ditën e 45-të pas trajtimit (15 ditë pas trajtimit të fundit). Çdo replikim biologjik përbëhej nga pesë vazo (dy bimë për vazo). Rreth 500 mg ind i grimcuar u përdor për nxjerrjen e pigmenteve fotosintetike (klorofil a, klorofil b dhe karotenoide) duke përdorur 80% aceton në 4 °C në errësirë. Pas 24 orësh, mostrat u centrifuguan dhe supernatanti u mblodh për përcaktimin e përmbajtjes së klorofilit a, klorofilit b dhe karotenoideve në mënyrë kolorimetrike duke përdorur një spektrofotometër UV-160A (Shimadzu Corporation, Japoni) sipas metodës së (Lichtenthaler, 1987) duke matur absorbimin në tre gjatësi vale të ndryshme (A470, A646 dhe A663 nm). Së fundmi, përmbajtja e pigmenteve fotosintetike u llogarit duke përdorur formulat e mëposhtme 4-6 të përshkruara nga Lichtenthaler (1987).
72 orë pas trajtimit (hpt), gjethet (gjethet e dyta dhe të treta të zhvilluara plotësisht nga lart) u mblodhën nga secila replikim biologjik për lokalizimin histokimik in situ të peroksidit të hidrogjenit (H2O2) dhe anionit të superoksidit (O2•−). Çdo replikim biologjik përbëhej nga pesë vazo (dy bimë për vazo). Çdo replikim biologjik u analizua në dy kopje (dy replikime teknike) për të siguruar saktësinë, besueshmërinë dhe riprodhueshmërinë e metodës. H2O2 dhe O2•− u përcaktuan duke përdorur përkatësisht 0.1% 3,3′-diaminobenzidinë (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Gjermani) ose nitroblue tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Gjermani), duke ndjekur metodat e përshkruara nga Romero-Puertas et al. (2004) dhe Adam et al. (1989) me modifikime të vogla. Për lokalizimin histokimik të H2O2 in situ, fletëpalosjet u infiltruan në vakum me 0.1% DAB në 10 mM tampon Tris (pH 7.8) dhe më pas u inkubuan në temperaturë ambienti në dritë për 60 minuta. Fletpalosjet u zbardhuan në 0.15% (v/v) TCA në 4:1 (v/v) etanol:kloroform (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egjipt) dhe më pas u ekspozuan në dritë derisa të errësoheshin. Në mënyrë të ngjashme, valvulat u infiltruan në vakum me 10 mM tampon fosfati kaliumi (pH 7.8) që përmbante 0.1 w/v % HBT për lokalizimin histokimik të O2•− in situ. Fletpalosjet u inkubuan në dritë në temperaturë ambienti për 20 minuta, më pas u zbardhuan si më sipër dhe më pas u ndriçuan derisa të shfaqeshin njolla blu/vjollcë të errëta. Intensiteti i ngjyrës kafe që rezulton (si një tregues H2O2) ose blu-vjollcë (si një tregues O2•−) u vlerësua duke përdorur versionin Fiji të paketës së përpunimit të imazhit ImageJ (http://fiji.sc; aksesuar më 7 Mars 2024).
Malonidialdehida (MDA; si një shënues i peroksidimit të lipideve) u përcaktua sipas metodës së Du dhe Bramlage (1992) me modifikime të vogla. Gjethet nga secila replikim biologjik (gjethe e dytë dhe e tretë e zhvilluar plotësisht nga maja) u mblodhën 72 orë pas trajtimit (hpt). Çdo replikim biologjik përfshinte pesë vazo (dy bimë për vazo). Çdo replikim biologjik u analizua në dy kopje (dy replikime teknike) për të siguruar saktësinë, besueshmërinë dhe riprodhueshmërinë e metodës. Shkurtimisht, 0.5 g ind gjethesh i bluar u përdor për nxjerrjen e MDA me 20% acid trikloroacetik (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, SHBA) që përmbante 0.01% hidroksitoluen të butiluar (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SHBA). Përmbajtja e MDA-së në supernatant u përcaktua më pas në mënyrë kolorimetrike duke matur absorbimin në 532 dhe 600 nm duke përdorur një spektrofotometër UV-160A (Shimadzu Corporation, Japoni) dhe më pas u shpreh si nmol g−1 FW.
Për vlerësimin e antioksidantëve jo-enzimatikë dhe enzimatikë, gjethet (gjethet e dyta dhe të treta të zhvilluara plotësisht nga lart) u mblodhën nga secila replikatë biologjike 72 orë pas trajtimit (hpt). Çdo replikatë biologjike përbëhej nga pesë vazo (dy bimë për vazo). Çdo mostër biologjike u analizua në dy kopje (dy mostra teknike). Dy gjethe u bluan me azot të lëngshëm dhe u përdorën direkt për përcaktimin e antioksidantëve enzimatikë dhe jo-enzimatikë, aminoacideve totale, përmbajtjes së prolinës, shprehjes së gjeneve dhe përcaktimit sasior të oksalatit.
Fenolet totale të tretshme u përcaktuan duke përdorur reagentin Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SHBA) me modifikime të vogla të metodës së përshkruar nga Kahkonen et al. (1999). Shkurtimisht, afërsisht 0.1 g ind i homogjenizuar i gjethes u nxorr me 20 ml metanol 80% në errësirë ​​për 24 orë dhe supernatanti u mblodh pas centrifugimit. 0.1 ml e ekstraktit të mostrës u përzie me 0.5 ml reagent Folin-Ciocalteu (10%), u tund për 30 sekonda dhe u la në errësirë ​​për 5 minuta. Pastaj 0.5 ml tretësirë ​​karbonati natriumi 20% (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Egjipt) u shtua në secilën tub, u përzie plotësisht dhe u inkubua në temperaturë ambienti në errësirë ​​për 1 orë. Pas inkubimit, absorbimi i përzierjes së reagimit u mat në 765 nm duke përdorur një spektrofotometër UV-160A (Shimadzu Corporation, Japoni). Përqendrimi i fenoleve totale të tretshme në ekstraktet e mostrës u përcaktua duke përdorur një kurbë kalibrimi të acidit galik (Fisher Scientific, Hampton, NH, SHBA) dhe u shpreh si miligramë ekuivalent i acidit galik për gram të peshës së freskët (mg GAE g-1 peshë e freskët).
Përmbajtja totale e flavonoideve të tretshme u përcaktua sipas metodës së Djeridane et al. (2006) me modifikime të vogla. Shkurtimisht, 0.3 ml e ekstraktit të metanolit të mësipërm u përzie me 0.3 ml tretësirë ​​klorur alumini 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, SHBA), u përzie fuqishëm dhe më pas u inkubua në temperaturë ambienti për 5 minuta, e ndjekur nga shtimi i 0.3 ml tretësirë ​​acetat kaliumi 10% (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egjipt), u përzie plotësisht dhe u inkubua në temperaturë ambienti për 30 minuta në errësirë. Pas inkubimit, thithja e përzierjes së reagimit u mat në 430 nm duke përdorur një spektrofotometër UV-160A (Shimadzu Corporation, Japoni). Përqendrimi i flavonoideve totale të tretshme në ekstraktet e mostrës u përcaktua duke përdorur një kurbë kalibrimi të rutinës (TCI America, Portland, OR, SHBA) dhe më pas u shpreh si miligramë ekuivalent i rutinës për gram të peshës së freskët (mg RE g-1 peshë e freskët).
Përmbajtja totale e aminoacideve të lira në gjethet e fasules u përcaktua duke përdorur një reagent të modifikuar të ninhidrinës (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, SHBA) bazuar në metodën e propozuar nga Yokoyama dhe Hiramatsu (2003) dhe të modifikuar nga Sun et al. (2006). Shkurtimisht, 0.1 g ind i bluar u nxorr me një tampon me pH 5.4, dhe 200 μL të supernatantit u reaguan me 200 μL ninhidrinë (2%) dhe 200 μL piridinë (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, SHBA), u inkubuan në një banjë me ujë të valë për 30 minuta, pastaj u ftohën dhe u matën në 580 nm duke përdorur një spektrofotometër UV-160A (Shimadzu Corporation, Japoni). Nga ana tjetër, prolina u përcaktua me metodën Bates (Bates et al., 1973). Prolina u nxor me 3% acid sulfosalicilik (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, SHBA) dhe pas centrifugimit, 0.5 ml e supernatantit u përzie me 1 ml acid acetik akullnajor (Fisher Scientific, Hampton, NH, SHBA) dhe reagentin e ninhidrinës, u inkubua në 90°C për 45 minuta, u ftoh dhe u mat në 520 nm duke përdorur të njëjtin spektrofotometër si më sipër. Totali i aminoacideve të lira dhe prolina në ekstraktet e gjetheve u përcaktuan duke përdorur përkatësisht kurbat e kalibrimit të glicinës dhe prolinës (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, SHBA), dhe u shprehën si mg/g peshë e freskët.
Për të përcaktuar aktivitetin enzimatik të enzimave antioksiduese, afërsisht 500 mg ind i homogjenizuar u nxorr me 3 ml tampon Tris 50 mM (pH 7.8) që përmbante 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SHBA) dhe 7.5% polivinilpirolidon (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SHBA), u centrifugua në 10,000 × g për 20 minuta në frigorifer (4 °C), dhe u mblodh supernatanti (ekstrakt i papërpunuar enzimatik) (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Katalaza (CAT) u reagua më pas me 2 ml tampon fosfati natriumi 0.1 M (pH 6.5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SHBA) dhe 100 μl tretësirë ​​H2O2 269 mM për të përcaktuar aktivitetin e saj enzimatik sipas metodës së Aebi (1984) me modifikime të vogla (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Aktiviteti enzimatik i peroksidazës së varur nga Guaiacol (POX) u përcaktua duke përdorur metodën e Harrach et al. (2009). (2008) me modifikime të vogla (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) dhe aktiviteti enzimatik i polifenol oksidazës (PPO) u përcaktua pas reagimit me 2.2 ml tampon fosfati natriumi 100 mM (pH 6.0), 100 μl guaiakol (TCI chemicals, Portland, OR, SHBA) dhe 100 μl H2O2 12 mM. Metoda u modifikua pak nga (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Analiza u krye pas reagimit me 3 ml tretësirë ​​katekoli (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, SHBA) (0.01 M) të përgatitur fllad në tampon fosfati 0.1 M (pH 6.0). Aktiviteti i CAT u mat duke monitoruar dekompozimin e H2O2 në 240 nm (A240), aktiviteti i POX u mat duke monitoruar rritjen e absorbimit në 436 nm (A436), dhe aktiviteti i PPO u mat duke regjistruar luhatjet e absorbimit në 495 nm (A495) çdo 30 s për 3 minuta duke përdorur një spektrofotometër UV-160A (Shimadzu, Japoni).
RT-PCR në kohë reale u përdor për të zbuluar nivelet e transkriptit të tre gjeneve të lidhura me antioksidantët, duke përfshirë katalazën peroksizomale (PvCAT1; Nr. i Hyrjes në GenBank KF033307.1), superoksid dismutazën (PvSOD; Nr. i Hyrjes në GenBank XM_068639556.1) dhe glutation reduktazën (PvGR; Nr. i Hyrjes në GenBank KY195009.1), në gjethet e fasules (gjethet e dyta dhe të treta të zhvilluara plotësisht nga lart) 72 orë pas trajtimit të fundit. Shkurtimisht, ARN-ja u izolua duke përdorur Simply P Total RNA Extraction Kit (Nr. i Katalogut BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Kinë) sipas protokollit të prodhuesit. Pastaj, ADNc u sintetizua duke përdorur TOP script™ cDNA Synthesis Kit sipas udhëzimeve të prodhuesit. Sekuencat e prajmerëve të tre gjeneve të mësipërme janë renditur në Tabelën Plotësuese S3. PvActin-3 (numri i hyrjes në GenBank: XM_068616709.1) u përdor si gjen i mirëmbajtjes së mjedisit dhe shprehja relative e gjenit u llogarit duke përdorur metodën 2-ΔΔCT (Livak dhe Schmittgen, 2001). U demonstrua stabiliteti i aktinës nën stres biotik (ndërveprim i papajtueshëm midis bishtajoreve të zakonshme dhe kërpudhës antrakonoze Colletotrichum lindemuthianum) dhe stresit abiotik (thatësira, kripësia, temperatura e ulët) (Borges et al., 2012).
Fillimisht kryem një analizë in silico në të gjithë gjenomin e proteinave të oksaloacetat acetilhidrolazës (OAH) në S. sclerotiorum duke përdorur mjetin proteinë-proteinë BLAST (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Shkurtimisht, përdorëm OAH nga Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taksid: 1191702; numri i hyrjes në GenBank XP_040799428.1; 342 aminoacide) dhe Penicillium lagena (PlOAH; taksid: 94218; numri i hyrjes në GenBank XP_056833920.1; 316 aminoacide) si sekuenca pyetjeje për të hartëzuar proteinën homologe në S. sclerotiorum (taksid: 5180). BLASTp u krye kundrejt të dhënave më të fundit të gjenomit të S. sclerotiorum në GenBank në faqen e internetit të Qendrës Kombëtare për Informacion Bioteknologjik (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Përveç kësaj, gjeni i parashikuar OAH nga S. sclerotiorum (SsOAH) dhe analiza evolucionare dhe pema filogjenetike e AfOAH nga A. fijiensis CBS 313.89 dhe PlOAH nga P. lagena u nxorën duke përdorur metodën e gjasës maksimale në MEGA11 (Tamura et al., 2021) dhe modelin e bazuar në matricë JTT (Jones et al., 1992). Pema filogjenetike u kombinua me analizën e shtrirjes së shumëfishtë të sekuencave të proteinave të të gjitha gjeneve të parashikuara OAH (SsOAH) nga S. sclerotiorum dhe sekuencën e pyetjes duke përdorur Mjetin e Shtrirjes së Bazuar në Kufizime (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos dhe Agarwala, 2007). Përveç kësaj, sekuencat e aminoacideve që përputheshin më mirë të SsOAH nga S. sclerotiorum u rreshtuan me sekuencat e pyetjes (AfOAH dhe PlOAH) (Larkin et al., 2007) duke përdorur ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), dhe rajonet e konservuara në rreshtim u vizualizuan duke përdorur mjetin ESPript (versioni 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Për më tepër, domenet përfaqësuese funksionale të parashikuara dhe vendet e konservuara të S. sclerotiorum SsOAH u klasifikuan në mënyrë interaktive në familje të ndryshme duke përdorur mjetin InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Së fundmi, modelimi i strukturës tre-dimensionale (3D) i SsOAH të parashikuar të S. sclerotiorum u krye duke përdorur Motorin e Njohjes së Homologjisë/Analogjisë së Proteinave (serveri Phyre2 versioni 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) dhe u validua duke përdorur serverin SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Strukturat e parashikuara tre-dimensionale (formati PDB) u vizualizuan në mënyrë interaktive duke përdorur paketën UCSF-Chimera (versioni 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al., 2004).
PCR sasiore fluoreshente në kohë reale u përdor për të përcaktuar nivelin transkriptues të oksaloacetat acetilhidrolazës (SsOAH; numri i hyrjes në GenBank: XM_001590428.1) në micelet e Sclerotinia sclerotiorum. Shkurtimisht, S. sclerotiorum u inokulua në një balonë që përmbante PDB dhe u vendos në një inkubator tundës (modeli: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, SHBA) në 25 ± 2 °C për 24 orë në 150 rpm dhe në errësirë ​​të vazhdueshme (24 orë) për të stimuluar rritjen e micelit. Më pas, qelizat u trajtuan me L-ornitinë dhe fungicidin Rizolex-T në përqendrime përfundimtare IC50 (përafërsisht 40 dhe 3.2 mg/L, përkatësisht) dhe më pas u kultivuan për 24 orë të tjera në të njëjtat kushte. Pas inkubimit, kulturat u centrifuguan në 2500 rpm për 5 minuta dhe supernatanti (miceli i kërpudhave) u mblodh për analizën e shprehjes së gjenit. Në mënyrë të ngjashme, miceli i kërpudhave u mblodh në 0, 24, 48, 72, 96 dhe 120 orë pas infeksionit nga bimët e infektuara që kishin formuar myk të bardhë dhe miceli pambuku në sipërfaqen e indeve të infektuara. ARN-ja u nxor nga miceli i kërpudhave dhe më pas ADNc-ja u sintetizua siç përshkruhet më sipër. Sekuencat e prajmerëve për SsOAH janë renditur në Tabelën Plotësuese S3. SsActina (numri i hyrjes në GenBank: XM_001589919.1) u përdor si gjen i mirëmbajtjes së mjedisit, dhe shprehja relative e gjenit u llogarit duke përdorur metodën 2-ΔΔCT (Livak dhe Schmittgen, 2001).
Acidi oksalik u përcaktua në lëngun e dekstrozës së patates (PDB) dhe në mostrat e bimëve që përmbanin patogjenin kërpudhor Sclerotinia sclerotiorum sipas metodës së Xu dhe Zhang (2000) me modifikime të vogla. Shkurtimisht, izolatet e S. sclerotiorum u inokuluan në shishe që përmbanin PDB dhe më pas u kultivuan në një inkubator që tundte (model I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, SHBA) në 150 rpm në 25 ± 2 °C për 3-5 ditë në errësirë ​​të vazhdueshme (24 orë) për të stimuluar rritjen e micelit. Pas inkubacionit, kultura e kërpudhave u filtrua së pari përmes letrës filtruese Whatman #1 dhe më pas u centrifugua në 2500 rpm për 5 minuta për të hequr micelin e mbetur. Supernatanti u mblodh dhe u ruajt në 4 °C për përcaktim të mëtejshëm sasior të oksalatit. Për përgatitjen e mostrave të bimëve, afërsisht 0.1 g fragmente të indeve bimore u nxorën tre herë me ujë të distiluar (2 ml çdo herë). Mostrat u centrifuguan më pas në 2500 rpm për 5 minuta, supernatanti u filtrua në gjendje të thatë përmes letrës filtruese Whatman Nr. 1 dhe u mblodh për analiza të mëtejshme.
Për analizën sasiore të acidit oksalik, përzierja e reagimit u përgatit në një tub qelqi me tapë sipas renditjes vijuese: 0.2 ml mostër (ose filtrat kulture PDB ose tretësirë ​​standarde e acidit oksalik), 0.11 ml blu bromofenoli (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, SHBA), 0.198 ml acid sulfurik 1 M (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egjipt) dhe 0.176 ml dikromat kaliumi 100 mM (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, SHBA), dhe më pas tretësira u hollua në 4.8 ml me ujë të distiluar, u përzie fuqishëm dhe u vendos menjëherë në një banjë uji 60 °C. Pas 10 minutash, reagimi u ndal duke shtuar 0.5 ml tretësirë ​​hidroksidi natriumi (NaOH; 0.75 M). Absorbimi (A600) i përzierjes së reagimit u mat në 600 nm duke përdorur një spektrofotometër UV-160 (Shimadzu Corporation, Japoni). PDB dhe uji i distiluar u përdorën si kontrolle për përcaktimin sasior të filtrateve të kulturës dhe mostrave të bimëve, përkatësisht. Përqendrimet e acidit oksalik në filtratet e kulturës, të shprehura si mikrogramë të acidit oksalik për mililitër të mjedisit PDB (μg.mL−1), dhe në ekstraktet e gjetheve, të shprehura si mikrogramë të acidit oksalik për gram të peshës së freskët (μg.g−1 FW), u përcaktuan duke përdorur një kurbë kalibrimi të acidit oksalik (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, SHBA).
Gjatë gjithë studimit, të gjitha eksperimentet u hartuan në një dizajn plotësisht të rastësishëm (CRD) me gjashtë replikime biologjike për trajtim dhe pesë vazo për replikim biologjik (dy bimë për vazo) përveç nëse përcaktohet ndryshe. Replikimet biologjike u analizuan në dy kopje (dy replikime teknike). Replikimet teknike u përdorën për të kontrolluar riprodhueshmërinë e të njëjtit eksperiment, por nuk u përdorën në analizën statistikore për të shmangur replikimet e rreme. Të dhënat u analizuan statistikisht duke përdorur analizën e variancës (ANOVA) e ndjekur nga testi i ndryshimit të ndershëm domethënës Tukey-Kramer (HSD) (p ≤ 0.05). Për eksperimentet in vitro, vlerat IC50 dhe IC99 u llogaritën duke përdorur modelin probit dhe u llogaritën intervale besimi 95%.
Një total prej katër izolatesh u mblodhën nga fusha të ndryshme soje në Guvernatoratin El Ghabiya, Egjipt. Në mjedisin PDA, të gjithë izolatet prodhuan miceli të bardhë kremoz që shpejt u kthye në të bardhë pambuku (Figura 1A) dhe më pas në ngjyrë bezhë ose kafe në fazën e sklerotiumit. Sklerociet zakonisht janë të dendura, të zeza, sferike ose në formë të çrregullt, 5.2 deri në 7.7 mm të gjata dhe 3.4 deri në 5.3 mm në diametër (Figura 1B). Megjithëse katër izolate zhvilluan një model margjinal të skleroteve në skajin e mjedisit të kulturës pas 10-12 ditësh inkubimi në 25 ± 2 °C (Fig. 1A), numri i skleroteve për pllakë ishte dukshëm i ndryshëm midis tyre (P < 0.001), me izolatin 3 që kishte numrin më të lartë të skleroteve (32.33 ± 1.53 skleroti për pllakë; Fig. 1C). Në mënyrë të ngjashme, izolati #3 prodhoi më shumë acid oksalik në PDB sesa izolatet e tjera (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; Fig. 1D). Izolati #3 tregoi karakteristika tipike morfologjike dhe mikroskopike të kërpudhës fitopatogjene Sclerotinia sclerotiorum. Për shembull, në PDA, kolonitë e izolatit #3 u rritën me shpejtësi, ishin të bardha kremoze (Figura 1A), ngjyrë bezhë të kundërt ose të verdhë-kafe të çelët në ngjyrë salmoni, dhe iu deshën 6-7 ditë në 25 ± 2°C për të mbuluar plotësisht sipërfaqen e një pllake me diametër 9 cm. Bazuar në karakteristikat morfologjike dhe mikroskopike të mësipërme, izolati #3 u identifikua si Sclerotinia sclerotiorum.
Figura 1. Karakteristikat dhe patogjeniteti i izolateve të S. sclerotiorum nga kulturat e zakonshme të bishtajoreve. (A) Rritja miceliale e katër izolateve të S. sclerotiorum në mjedisin PDA, (B) sklerotiet e katër izolateve të S. sclerotiorum, (C) numri i sklerotieve (për pjatë), (D) sekretimi i acidit oksalik në mjedisin PDB (μg.mL−1), dhe (E) ashpërsia e sëmundjes (%) e katër izolateve të S. sclerotiorum në kultivarin e ndjeshëm të bishtajoreve komerciale Giza 3 në kushte serre. Vlerat përfaqësojnë mesataren ± SD të pesë replikimeve biologjike (n = 5). Shkronjat e ndryshme tregojnë ndryshime statistikisht të rëndësishme midis trajtimeve (p < 0.05). (F–H) Simptomat tipike të mykut të bardhë u shfaqën në kërcej dhe silike mbi tokë, përkatësisht, 10 ditë pas inokulimit me izolatin #3 (dpi). (I) Analiza evolucionare e rajonit të transkriptuar të brendshëm (ITS) të izolatit #3 të S. sclerotiorum u krye duke përdorur metodën e gjasës maksimale dhe u krahasua me 20 izolate/lloje reference të marra nga baza e të dhënave e Qendrës Kombëtare për Informacion Bioteknologjik (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Numrat mbi vijat e grupimit tregojnë mbulimin e rajonit (%), dhe numrat poshtë vijave të grupimit tregojnë gjatësinë e degës.
Për më tepër, për të konfirmuar patogjenitetin, katër izolate të marra të S. sclerotiorum u përdorën për të inokuluar kultivarin e ndjeshëm të fasules komerciale Giza 3 në kushte serre, gjë që është në përputhje me postulatet e Koch-ut (Fig. 1E). Edhe pse të gjitha izolatet e marra të kërpudhave ishin patogjene dhe mund të infektonin fasulen e gjelbër (cv. Giza 3), duke shkaktuar simptoma tipike të mykut të bardhë në të gjitha pjesët mbi tokë (Fig. 1F), veçanërisht në kërcell (Fig. 1G) dhe bishtaja (Fig. 1H) 10 ditë pas inokulimit (dpi), izolati 3 ishte izolati më agresiv në dy eksperimente të pavarura. Izolati 3 kishte ashpërsinë më të lartë të sëmundjes (%) në bimët e fasules (24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0 dhe 76.7 ± 3.1 në 7, 14 dhe 21 ditë pas infeksionit, përkatësisht; Figura 1F).
Identifikimi i izolatit më invaziv të S. sclerotiorum #3 u konfirmua më tej bazuar në sekuencimin e internal transkript spacer (ITS) (Fig. 1I). Analiza filogjenetike midis izolatit #3 dhe 20 izolateve/llojeve referuese tregoi ngjashmëri të lartë (>99%) midis tyre. Vlen të përmendet se izolati #3 i S. sclerotiorum (533 bp) ka një ngjashmëri të lartë me izolatin amerikan të S. sclerotiorum LPM36 të izoluar nga farat e thata të bizeleve (numri i hyrjes në GenBank MK896659.1; 540 bp) dhe izolatin kinez të S. sclerotiorum YKY211 (numri i hyrjes në GenBank OR206374.1; 548 bp), i cili shkakton kalbjen e kërcellit të vjollcës (Matthiola incana), të cilat të gjitha grupohen veçmas në krye të dendrogramit (Figura 1I). Sekuenca e re është depozituar në bazën e të dhënave NCBI dhe është emëruar "Sclerotinia sclerotiorum – izolati YN-25" (numri i hyrjes në GenBank PV202792). Mund të shihet se izolati 3 është izolati më invaziv; prandaj, ky izolat u zgjodh për studim në të gjitha eksperimentet pasuese.
Aktiviteti antibakterial i diaminës L-ornitinë (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Gjermani) në përqendrime të ndryshme (12.5, 25, 50, 75, 100 dhe 125 mg/L) kundër izolatit 3 të S. sclerotiorum u hetua in vitro. Vlen të përmendet se L-ornitina ushtroi një efekt antibakterial dhe gradualisht pengoi rritjen radiale të hifave të S. sclerotiorum në një mënyrë të varur nga doza (Figura 2A, B). Në përqendrimin më të lartë të testuar (125 mg/L), L-ornitina tregoi shkallën më të lartë të frenimit të rritjes miceliale (99.62 ± 0.27%; Figura 2B), e cila ishte ekuivalente me fungicidin komercial Rizolex-T (shkalla e frenimit 99.45 ± 0.39%; Figura 2C) në përqendrimin më të lartë të testuar (10 mg/L), duke treguar efikasitet të ngjashëm.
Figura 2. Aktiviteti antibakterial in vitro i L-ornitinës kundër Sclerotinia sclerotiorum. (A) Krahasimi i aktivitetit antibakterial të përqendrimeve të ndryshme të L-ornitinës kundër S. sclerotiorum me fungicidin komercial Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Shkalla e frenimit (%) e rritjes miceliale të S. sclerotiorum pas trajtimit me përqendrime të ndryshme të L-ornitinës (12.5, 25, 50, 75, 100 dhe 125 mg/L) ose Rizolex-T (2, 4, 6, 8 dhe 10 mg/L), përkatësisht. Vlerat përfaqësojnë mesataren ± SD të pesë replikimeve biologjike (n = 5). Shkronja të ndryshme tregojnë ndryshime statistikore midis trajtimeve (p < 0.05). (D, E) Analiza e regresionit të modelit Probit të L-ornitinës dhe fungicidit komercial Rizolex-T, përkatësisht. Vija e regresionit të modelit probit tregohet si një vijë blu e plotë, dhe intervali i besimit (95%) tregohet si një vijë e kuqe e ndërprerë.
Përveç kësaj, u krye analiza e regresionit probit dhe grafikët përkatës tregohen në Tabelën 1 dhe Figurat 2D,E. Shkurtimisht, vlera e pjerrësisë së pranueshme (y = 2.92x - 4.67) dhe statistikat e rëndësishme shoqëruese (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 dhe p < 0.0001; Figura 2D) e L-ornitinës treguan një aktivitet të shtuar antifungal kundër S. sclerotiorum krahasuar me fungicidin komercial Rizolex-T (y = 1.96x - 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 dhe p < 0.0001) (Tabela 1).
Tabela 1. Vlerat e gjysmës së përqendrimit frenues maksimal (IC50) dhe IC99 (mg/l) të L-ornitinës dhe fungicidit komercial “Rizolex-T” kundër S. sclerotiorum.
Në përgjithësi, L-ornitina (250 mg/L) uli ndjeshëm zhvillimin dhe ashpërsinë e mykut të bardhë në bimët e trajtuara të fasules së zakonshme krahasuar me bimët e infektuara me S. sclerotiorum të patrajtuara (kontroll; Figura 3A). Shkurtimisht, megjithëse ashpërsia e sëmundjes së bimëve të kontrollit të infektuara të patrajtuara u rrit gradualisht (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61 dhe 92.33 ± 3.06%), L-ornitina uli ndjeshëm ashpërsinë e sëmundjes (%) gjatë gjithë eksperimentit (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00 dhe 26.36 ± 3.07) përkatësisht në 7, 14 dhe 21 ditë pas trajtimit (dpt) (Figura 3A). Në mënyrë të ngjashme, kur bimët e fasules së infektuara me S. sclerotiorum u trajtuan me 250 mg/L L-ornitinë, zona nën kurbën e përparimit të sëmundjes (AUDPC) u ul nga 1274.33 ± 33.13 në kontrollin e patrajtuar në 281.03 ± 7.95, e cila ishte pak më e ulët se ajo e kontrollit pozitiv 50 mg/L fungicid Rizolex-T (183.61 ± 7.71; Fig. 3B). E njëjta tendencë u vu re në eksperimentin e dytë.
Fig. 3. Efekti i aplikimit ekzogjen të L-ornitinës në zhvillimin e kalbjes së bardhë të fasules së zakonshme të shkaktuar nga Sclerotinia sclerotiorum në kushte serre. (A) Kurba e përparimit të sëmundjes së mykut të bardhë të fasules së zakonshme pas trajtimit me 250 mg/L L-ornitinë. (B) Sipërfaqja nën kurbën e përparimit të sëmundjes (AUDPC) e mykut të bardhë të fasules së zakonshme pas trajtimit me L-ornitinë. Vlerat përfaqësojnë mesataren ± SD të pesë replikimeve biologjike (n = 5). Shkronja të ndryshme tregojnë ndryshime statistikisht të rëndësishme midis trajtimeve (p < 0.05).
Aplikimi ekzogjen i 250 mg/L L-ornitinë rriti gradualisht lartësinë e bimës (Fig. 4A), numrin e degëve për bimë (Fig. 4B) dhe numrin e gjetheve për bimë (Fig. 4C) pas 42 ditësh. Ndërsa fungicidi komercial Rizolex-T (50 mg/L) pati efektin më të madh në të gjithë parametrat ushqyes të studiuar, aplikimi ekzogjen i 250 mg/L L-ornitinë pati efektin e dytë më të madh krahasuar me kontrollet e patrajtuara (Fig. 4A–C). Nga ana tjetër, trajtimi me L-ornitinë nuk pati efekt të rëndësishëm në përmbajtjen e pigmenteve fotosintetike klorofil a (Fig. 4D) dhe klorofil b (Fig. 4E), por rriti pak përmbajtjen totale të karotenoideve (0.56 ± 0.03 mg/g për peshë) krahasuar me kontrollin negativ (0.44 ± 0.02 mg/g për peshë) dhe kontrollin pozitiv (0.46 ± 0.02 mg/g për peshë; Fig. 4F). Në përgjithësi, këto rezultate tregojnë se L-ornitina nuk është fitotoksike për bishtajoret e trajtuara dhe madje mund të stimulojë rritjen e tyre.
Fig. 4. Efekti i aplikimit ekzogjen të L-ornitinës në karakteristikat e rritjes dhe pigmentet fotosintetike të gjetheve të fasules së infektuar me Sclerotinia sclerotiorum në kushte serre. (A) Lartësia e bimës (cm), (B) Numri i degëve për bimë, (C) Numri i gjetheve për bimë, (D) Përmbajtja e klorofilës a (mg g-1 fr wt), (E) Përmbajtja e klorofilës b (mg g-1 fr wt), (F) Përmbajtja totale e karotenoideve (mg g-1 fr wt). Vlerat janë mesatarja ± SD e pesë replikimeve biologjike (n = 5). Shkronjat e ndryshme tregojnë ndryshime statistikisht të rëndësishme midis trajtimeve (p < 0.05).
Lokalizimi histokimik in situ i specieve reaktive të oksigjenit (ROS; i shprehur si peroksid hidrogjeni [H2O2]) dhe radikaleve të lira (të shprehura si anione superoksidi [O2•−]) zbuloi se aplikimi ekzogjen i L-ornitinës (250 mg/L) uli ndjeshëm akumulimin e H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; Fig. 5A) dhe O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) krahasuar me akumulimin e bimëve të infektuara të patrajtuara (përkatësisht 173.31 ± 12.06 dhe 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW) dhe bimëve të trajtuara me 50 mg/L të fungicidit komercial Rizolex-T (përkatësisht 170.12 ± 9.50 dhe 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt) në 72 orë. Nivele të larta të H2O2 dhe O2•− u grumbulluan nën hpt (Fig. 5A, B). Në mënyrë të ngjashme, analiza e malondialdehidës (MDA) me bazë TCA tregoi se bimët e fasules së infektuar me S. sclerotiorum grumbulluan nivele më të larta të MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g për peshë) në gjethet e tyre (Fig. 5C). Megjithatë, aplikimi ekzogjen i L-ornitinës uli ndjeshëm peroksidimin e lipideve, siç dëshmohet nga ulja e përmbajtjes së MDA në bimët e trajtuara (33.08 ± 4.00 nmol.g për peshë).
Fig. 5. Efekti i aplikimit ekzogjen të L-ornitinës në shënuesit kryesorë të stresit oksidativ dhe mekanizmave mbrojtës antioksidues jo-enzimatikë në gjethet e fasules së infektuar me S. sclerotiorum 72 orë pas infeksionit në kushte serre. (A) Peroksid hidrogjeni (H2O2; nmol g−1 FW) në 72 hpt, (B) anioni superoksid (O2•−; nmol g−1 FW) në 72 hpt, (C) malondialdehida (MDA; nmol g−1 FW) në 72 hpt, (D) fenole totale të tretshme (mg GAE g−1 FW) në 72 hpt, (E) flavonoide totale të tretshme (mg RE g−1 FW) në 72 hpt, (F) aminoacidet totale të lira (mg g−1 FW) në 72 hpt, dhe (G) përmbajtja e prolinës (mg g−1 FW) në 72 hpt. Vlerat përfaqësojnë mesataren ± devijimin standard (mesatarja ± SD) të 5 replikimeve biologjike (n = 5). Shkronjat e ndryshme tregojnë ndryshime statistikisht të rëndësishme midis trajtimeve (p < 0.05).