Faleminderit që vizituat Nature.com. Versioni i shfletuesit që po përdorni ka mbështetje të kufizuar për CSS. Për përvojën më të mirë, ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose të çaktivizoni modalitetin e përputhshmërisë në Internet Explorer). Ndërkohë, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne do ta shfaqim faqen pa stile dhe JavaScript.
Nanopjesëzat e insulinës (NP) me përmbajtje të lartë ngarkese kanë gjetur zbatime të ndryshme në forma të ndryshme dozimi. Ky punim synon të vlerësojë efektin e proceseve të tharjes me ngrirje dhe tharjes me spërkatje në strukturën e nanopjesëzave të kitosanit të ngarkuara me insulinë, me ose pa manitol si një krioprotektues. Ne gjithashtu vlerësuam cilësinë e këtyre nanopjesëzave duke i ritretur ato. Para dehidratimit, madhësia e grimcave të nanopjesëzave të lidhura me kryqëzim të kitosanit/tripolifosfatit të natriumit/insulinës u optimizua të ishte 318 nm, PDI ishte 0.18, efikasiteti i enkapsulimit ishte 99.4% dhe ngarkimi ishte 25.01%. Pas rikonstituimit, të gjitha nanopjesëzat, përveç atyre të prodhuara me një metodë tharjeje me ngrirje pa përdorimin e manitolit, ruajtën strukturën e tyre sferike të grimcave. Krahasuar me nanopjesëzat që përmbajnë manitol të dehidratuara me spërkatje, nanopjesëzat e thara me spërkatje pa manitol treguan gjithashtu madhësinë mesatare më të vogël të grimcave (376 nm) dhe përmbajtjen më të lartë të ngarkimit. (25.02%) me shkallë të ngjashme enkapsulimi (98.7%) dhe PDI (0.20) me anë të teknikave të tharjes ose tharjes me ngrirje. Nanopjesëzat e thara me anë të tharjes me spërkatje pa manitol rezultuan gjithashtu në çlirimin më të shpejtë të insulinës dhe efikasitetin më të lartë të thithjes qelizore. Kjo punë tregon se tharja me spërkatje mund të dehidratojë nanopjesëzat e insulinës pa nevojën për krioprotektues krahasuar me metodat konvencionale të tharjes me ngrirje, duke krijuar një kapacitet më të madh ngarkimi, kërkesa më të ulëta për aditivët dhe një avantazh të rëndësishëm për kostot operative.
Që nga zbulimi i saj në vitin 19221,2,3, insulina dhe preparatet e saj farmaceutike kanë shpëtuar jetën e pacientëve me diabet të tipit 1 (T1DM) dhe diabet të tipit 2 (T1DM). Megjithatë, për shkak të vetive të saj si një proteinë me peshë të lartë molekulare, insulina grumbullohet lehtësisht, zbërthehet nga enzimat proteolitike dhe eliminohet nga efekti i kalimit të parë. Njerëzit e diagnostikuar me diabet të tipit 1 kanë nevojë për injeksione insuline për pjesën tjetër të jetës së tyre. Shumë pacientë të diagnostikuar fillimisht me diabet të tipit 2 gjithashtu kërkojnë injeksione afatgjata të insulinës. Injeksionet ditore të insulinës janë një burim serioz dhimbjeje dhe shqetësimi të përditshëm për këta individë, me efekte negative në shëndetin mendor. Si rezultat, format e tjera të administrimit të insulinës që shkaktojnë më pak shqetësim, siç është administrimi oral i insulinës, po studiohen gjerësisht5 pasi ato kanë potencialin të rivendosin cilësinë e jetës së afërsisht 5 miliardë njerëzve me diabet në të gjithë botën.
Teknologjia e nanopjesëzave ka ofruar një përparim të konsiderueshëm në përpjekjet për të marrë insulinë orale4,6,7. Një teknologji që e kapsulon dhe mbron në mënyrë efektive insulinën nga degradimi për shpërndarje të synuar në vende specifike të trupit. Megjithatë, përdorimi i formulimeve të nanopjesëzave ka disa kufizime, kryesisht për shkak të problemeve të stabilitetit të pezullimeve të grimcave. Mund të ndodhë njëfarë grumbullimi gjatë ruajtjes, gjë që zvogëlon biodisponueshmërinë e nanopjesëzave të ngarkuara me insulinë8. Përveç kësaj, duhet të merret në konsideratë edhe stabiliteti kimik i matricës polimerike të nanopjesëzave dhe insulinës për të siguruar stabilitetin e nanopjesëzave të insulinës (NP). Aktualisht, teknologjia e tharjes me ngrirje është standardi i artë për krijimin e NP-ve të qëndrueshme, duke parandaluar njëkohësisht ndryshimet e padëshiruara gjatë ruajtjes9.
Megjithatë, tharja me ngrirje kërkon shtimin e krioprotektorëve për të parandaluar që struktura sferike e NP-ve të preket nga stresi mekanik i kristaleve të akullit. Kjo zvogëlon ndjeshëm ngarkesën e nanopjesëzave të insulinës pas liofilizimit, pasi krioprotektorët zënë pjesën më të madhe të raportit të peshës. Prandaj, NP-të e insulinës të prodhuara shpesh gjenden të papërshtatshme për prodhimin e formulimeve të pluhurit të thatë, siç janë tabletat orale dhe filmat oral, për shkak të nevojës për sasi të mëdha të nanopjesëzave të thata për të arritur dritaren terapeutike të insulinës.
Tharja me spërkatje është një proces i njohur dhe i lirë në shkallë industriale për prodhimin e pluhurave të thata nga fazat e lëngshme në industrinë farmaceutike10,11. Kontrolli mbi procesin e formimit të grimcave lejon enkapsulimin e duhur të disa komponimeve bioaktive12, 13. Për më tepër, është bërë një teknikë efektive për përgatitjen e proteinave të enkapsuluara për administrim oral. Gjatë tharjes me spërkatje, uji avullohet shumë shpejt, gjë që ndihmon në mbajtjen e temperaturës së bërthamës së grimcave të ulët11,14, duke mundësuar aplikimin e tij për të enkapsuluar përbërësit e ndjeshëm ndaj nxehtësisë. Para tharjes me spërkatje, materiali i veshjes duhet të homogjenizohet plotësisht me tretësirën që përmban përbërësit e enkapsuluar11,14. Ndryshe nga tharja me ngrirje, homogjenizimi para enkapsulimit në tharjen me spërkatje përmirëson efikasitetin e enkapsulimit gjatë dehidratimit. Meqenëse procesi i enkapsulimit me tharje me spërkatje nuk kërkon krioprojektë, tharja me spërkatje mund të përdoret për të prodhuar NP të thata me përmbajtje të lartë ngarkese.
Ky studim raporton prodhimin e nanopartikulave të ngarkuara me insulinë duke lidhur kitosanin dhe tripolifosfatin e natriumit duke përdorur një metodë xheli jonik. Xhelimi jonik është një metodë përgatitjeje që lejon prodhimin e nanopjesëzave përmes ndërveprimeve elektrostatike midis dy ose më shumë specieve jonike në kushte të caktuara. Teknikat e tharjes me ngrirje dhe tharjes me spërkatje u përdorën për të dehidratuar nanopjesëzat e optimizuara të lidhura kryqëzisht me kitosan/tripolifosfat natriumi/insulinë. Pas dehidratimit, morfologjia e tyre u analizua me SEM. Aftësia e tyre e rikombinimit u vlerësua duke matur shpërndarjen e tyre të madhësisë, ngarkesën sipërfaqësore, PDI-në, efikasitetin e enkapsulimit dhe përmbajtjen e ngarkimit. Cilësia e nanopjesëzave të ritretura të prodhuara me metoda të ndryshme dehidratimi u vlerësua gjithashtu duke krahasuar mbrojtjen e tyre ndaj insulinës, sjelljen e çlirimit dhe efikasitetin e thithjes qelizore.
pH i tretësirës së përzier dhe raporti i kitosanit dhe insulinës janë dy faktorë kryesorë që ndikojnë në madhësinë e grimcave dhe efikasitetin e enkapsulimit (EE) të NP-ve përfundimtare, pasi ato ndikojnë drejtpërdrejt në procesin e xhelatinimit jonotropik. pH i tretësirës së përzier u tregua se ishte shumë i korreluar me madhësinë e grimcave dhe efikasitetin e enkapsulimit (Fig. 1a). Siç tregohet në Fig. 1a, ndërsa pH u rrit nga 4.0 në 6.0, madhësia mesatare e grimcave (nm) u ul dhe EE u rrit ndjeshëm, ndërsa kur pH u rrit në 6.5, madhësia mesatare e grimcave filloi të rritet dhe EE mbeti e pandryshuar. Ndërsa raporti i kitosanit ndaj insulinës rritet, rritet edhe madhësia mesatare e grimcave. Për më tepër, nuk u vu re asnjë ndryshim në EE kur nanopjesëzat u përgatitën në një raport masiv të kitosanit/insulinës më të lartë se 2.5:1 (p/p) (Fig. 1b). Prandaj, kushtet optimale të përgatitjes në këtë studim (pH 6.0, raporti masiv i kitosanit/insulinës prej 2.5:1) u përdorën për të përgatitur nanopjesëza të ngarkuara me insulinë për studime të mëtejshme. Nën këto kushte përgatitjeje, madhësia mesatare e grimcave të nanopjesëzave të insulinës u optimizua të ishte 318 nm (Fig. 1c), PDI ishte 0.18, efikasiteti i ngulitjes ishte 99.4%, potenciali zeta ishte 9.8 mv dhe ngarkesa e insulinës ishte 25.01% (m2/m2). Bazuar në rezultatet e mikroskopisë elektronike të transmetimit (TEM), nanopjesëzat e optimizuara ishin afërsisht sferike dhe diskrete me madhësi relativisht uniforme (Fig. 1d).
Optimizimi i parametrave të nanopjesëzave të insulinës: (a) efekti i pH-it në diametrin mesatar dhe efikasitetin e enkapsulimit (EE) të nanopjesëzave të insulinës (të përgatitura në raportin masiv 5:1 të kitosanit dhe insulinës); (b) kitosan dhe ndikimi i raportit masiv të insulinës në diametrin mesatar dhe efikasitetin e enkapsulimit (EE) të nanopartikulave të insulinës (të përgatitura në pH 6); (c) shpërndarja e madhësisë së grimcave të nanopjesëzave të optimizuara të insulinës; (d) mikrografi TEM e nanopartikulave të optimizuara të insulinës.
Dihet mirë që kitozani është një polielektrolit i dobët me një pKa prej 6.5. Ai është i ngarkuar pozitivisht në mjedise acidike sepse grupi i tij kryesor amino protonohet nga jonet e hidrogjenit15. Prandaj, shpesh përdoret si bartës për të enkapsuluar makromolekulat e ngarkuara negativisht. Në këtë studim, kitozani u përdor për të enkapsuluar insulinën me një pikë izoelektrike prej 5.3. Meqenëse kitozani përdoret si material veshës, me rritjen e proporcionit të tij, trashësia e shtresës së jashtme të nanopjesëzave rritet përkatësisht, duke rezultuar në një madhësi mesatare më të madhe të grimcave. Përveç kësaj, nivele më të larta të kitozanit mund të enkapsulojnë më shumë insulinë. Në rastin tonë, EE ishte më e larta kur raporti i kitozanit dhe insulinës arriti në 2.5:1, dhe nuk kishte ndryshim të rëndësishëm në EE kur raporti vazhdoi të rritej.
Përveç raportit të kitosanit dhe insulinës, pH luajti gjithashtu një rol vendimtar në përgatitjen e NP-ve. Gan et al. 17 studiuan efektin e pH në madhësinë e grimcave të nanopjesëzave të kitosanit. Ata gjetën një rënie të vazhdueshme të madhësisë së grimcave derisa pH arriti në 6.0, dhe një rritje e konsiderueshme e madhësisë së grimcave u vu re në pH > 6.0, gjë që është në përputhje me vëzhgimet tona. Ky fenomen është për shkak të faktit se me rritjen e pH, molekula e insulinës fiton një ngarkesë negative sipërfaqësore, duke favorizuar kështu ndërveprimet elektrostatike me kompleksin kitosan/tripolifosfat natriumi (TPP), duke rezultuar në madhësi të vogël të grimcave dhe EE të lartë. Megjithatë, kur pH u rregullua në 6.5, grupet amino në kitosan u deprotonuan, duke rezultuar në palosjen e kitosanit. Kështu, pH i lartë rezulton në më pak ekspozim të joneve amino ndaj TPP dhe insulinës, duke rezultuar në lidhje më të ulët, madhësi mesatare përfundimtare më të madhe të grimcave dhe EE më të ulët.
Analiza e vetive morfologjike të NP-ve të thara me ngrirje dhe të thara me spërkatje mund të udhëheqë përzgjedhjen e teknikave më të mira të dehidratimit dhe formimit të pluhurit. Metoda e preferuar duhet të ofrojë stabilitet të ilaçit, formë uniforme të grimcave, ngarkesë të lartë të ilaçit dhe tretshmëri të mirë në tretësirën origjinale. Në këtë studim, për të krahasuar më mirë dy teknikat, gjatë dehidratimit u përdorën NP-të e insulinës me ose pa 1% manitol. Manitoli përdoret si agjent mbushës ose krioprotektiv në formulime të ndryshme të pluhurit të thatë për tharje me ngrirje dhe tharje me spërkatje. Për nanopjesëzat e insulinës së liofilizuar pa manitol, siç tregohet në Figurën 2a, një strukturë pluhuri shumë poroze me sipërfaqe të mëdha, të çrregullta dhe të ashpra u vu re nën mikroskopinë elektronike skanuese (SEM). Pak grimca diskrete u zbuluan në pluhur pas dehidratimit (Fig. 2e). Këto rezultate treguan se shumica e NP-ve u dekompozuan gjatë tharjes me ngrirje pa asnjë krioprotektiv. Për nanopjesëzat e insulinës të thara me ngrirje dhe të thara me spërkatje që përmbajnë 1% manitol, u vunë re nanopjesëza sferike me sipërfaqe të lëmuara (Fig. 2b, d, f, h). Nanopjesëzat e insulinës të thara me spërkatje pa manitol mbetën sferike, por të rrudhura në sipërfaqe (Fig. 2c). Sipërfaqet sferike dhe të rrudhura diskutohen më tej në testet e sjelljes së çlirimit dhe thithjes qelizore më poshtë. Bazuar në pamjen e dukshme të NP-ve të thara, si NP-të e thara me spërkatje pa manitol ashtu edhe NP-të e ngrirë dhe të thara me spërkatje me manitol dhanë pluhura të imëta NP-sh (Fig. 2f, g, h). Sa më e madhe të jetë sipërfaqja midis sipërfaqeve të grimcave, aq më e lartë është tretshmëria dhe për këtë arsye aq më e lartë është shkalla e çlirimit.
Morfologjia e NP-ve të ndryshme të insulinës së dehidratuar: (a) Imazh SEM i NP-ve të insulinës së liofilizuar pa manitol; (b) Imazh SEM i NP-ve të insulinës së liofilizuar me manitol; (c) NP të insulinës të thara me spraj pa manitol Imazh SEM i ; (d) Imazh SEM i NP-ve të insulinës të thara me spraj me manitol; (e) imazh i pluhurit të NP-ve të insulinës së liofilizuar pa manitol; (f) imazh i NP-ve të insulinës së liofilizuar me manitol; (g) Imazh i pluhurit të NP-ve të insulinës të thara me spraj pa manitol; (h) imazh i pluhurit të NP-ve të insulinës të thara me spraj me manitol.
Gjatë tharjes me ngrirje, manitoli vepron si një krioprotektues, duke i mbajtur NP-të në një formë amorfe dhe duke parandaluar dëmtimin nga kristalet e akullit19. Në të kundërt, nuk ka hap ngrirjeje gjatë tharjes me spërkatje. Prandaj, manitoli nuk kërkohet në këtë metodë. Në fakt, NP-të e thara me spërkatje pa manitol dhanë NP më të imëta siç është përshkruar më parë. Megjithatë, manitoli mund të veprojë ende si një mbushës në procesin e tharjes me spërkatje për t'u dhënë NP-ve një strukturë më sferike20 (Fig. 2d), e cila ndihmon në arritjen e sjelljes uniforme të çlirimit të NP-ve të tilla të kapsuluara. Përveç kësaj, është e qartë se disa grimca të mëdha mund të zbulohen si në NP-të e insulinës të thara me ngrirje ashtu edhe në ato të thara me spërkatje që përmbajnë manitol (Fig. 2b, d), gjë që mund të jetë për shkak të akumulimit të manitolit në bërthamën e grimcave së bashku me insulinën e kapsuluar. Shtresa e kitosanit. Vlen të përmendet se në këtë studim, për të siguruar që struktura sferike të mbetet e paprekur pas dehidratimit, raporti i manitolit dhe kitosanit mbahet në 5:1, në mënyrë që një sasi e madhe mbushësi të mund të zmadhojë edhe madhësinë e grimcave të NP-ve të thata.
Spektroskopia e reflektimit total të dobësuar me infra të kuqe të transformimit Furier (FTIR-ATR) karakterizoi përzierjen fizike të insulinës së lirë, kitosanit, kitosanit, TPP dhe insulinës. Të gjitha NP-të e dehidratuara u karakterizuan duke përdorur spektroskopinë FTIR-ATR. Veçanërisht, intensitetet e brezave prej 1641, 1543 dhe 1412 cm-1 u vunë re në NP-të e kapsuluara të thara me ngrirje me manitol dhe në NP-të e thara me spërkatje me dhe pa manitol (Fig. 3). Siç është raportuar më parë, këto rritje në forcë u shoqëruan me lidhje të kryqëzuara midis kitosanit, TPP dhe insulinës. Hetimi i ndërveprimit midis kitosanit dhe insulinës tregoi se në spektrat FTIR të nanopjesëzave të kitosanit të ngarkuara me insulinë, brezi i kitosanit mbivendosej me atë të insulinës, duke rritur intensitetin karbonil (1641 cm-1) dhe brezin e aminës (1543 cm-1). Grupet tripolifosfat të TPP janë të lidhura me grupet e amonit në kitosan, duke formuar një brezi në 1412 cm-1.
Spektrat FTIR-ATR të insulinës së lirë, kitosanit, përzierjeve fizike të kitosanit/TPP/insulinës dhe NP-ve të dehidratuara me metoda të ndryshme.
Për më tepër, këto rezultate janë në përputhje me ato të treguara në SEM, të cilat treguan se NP-të e kapsuluara mbetën të paprekura si kur u spërkatën ashtu edhe kur u ngrinë me manitol, por në mungesë të manitolit, vetëm tharja me spërkatje prodhoi grimca të kapsuluara. Në të kundërt, rezultatet spektrale FTIR-ATR të NP-ve të ngrirë pa manitol ishin shumë të ngjashme me përzierjen fizike të kitosanit, TPP dhe insulinës. Ky rezultat tregon se lidhjet kryq midis kitosanit, TPP dhe insulinës nuk janë më të pranishme në NP-të e ngrirë pa manitol. Struktura e NP-ve u shkatërrua gjatë tharjes me ngrirje pa krioprotektues, gjë që mund të shihet në rezultatet e SEM (Fig. 2a). Bazuar në morfologjinë dhe rezultatet FTIR të NP-ve të insulinës së dehidratuar, vetëm NP-të e liofilizuara, të thara me spërkatje dhe pa manitol u përdorën për eksperimentet e rindërtimit dhe NP-të pa manitol për shkak të dekompozimit të NP-ve pa manitol gjatë dehidratimit. diskutoni.
Dehidratimi përdoret për ruajtje afatgjatë dhe ripërpunim në formulime të tjera. Aftësia e NP-ve të thata për t'u rikonstituuar pas ruajtjes është kritike për përdorimin e tyre në formulime të ndryshme si tableta dhe filma. Ne vumë re se madhësia mesatare e grimcave të NP-ve të insulinës të thara me spraj në mungesë të manitolit u rrit vetëm pak pas rikonstituimit. Nga ana tjetër, madhësia e grimcave të nanopjesëzave të insulinës të thara me spraj dhe të ngrira me manitol u rrit ndjeshëm (Tabela 1). PDI dhe EE nuk u ndryshuan ndjeshëm (p > 0.05) pas rikombinimit të të gjitha NP-ve në këtë studim (Tabela 1). Ky rezultat tregon se shumica e grimcave mbetën të paprekura pas ritreturjes. Megjithatë, shtimi i manitolit rezultoi në një ulje të ndjeshme të ngarkesës së insulinës së nanopjesëzave të manitolit të liofilizuara dhe të thara me spraj (Tabela 1). Në të kundërt, përmbajtja e ngarkesës së insulinës së NP-ve të thara me spraj pa manitol mbeti e njëjtë si më parë (Tabela 1).
Dihet mirë se ngarkesa e nanopjesëzave është kritike kur përdoret për qëllime të administrimit të barnave. Për NP-të me ngarkesa të ulëta, kërkohen sasi shumë të mëdha materiali për të arritur pragun terapeutik. Megjithatë, viskoziteti i lartë i përqendrimeve kaq të larta të NP-ve çon në shqetësime dhe vështirësi në administrimin oral dhe formulimet e injektueshme, përkatësisht 22. Përveç kësaj, NP-të e insulinës mund të përdoren gjithashtu për të bërë tableta dhe biofilma viskozë 23, 24, gjë që kërkon përdorimin e sasive të mëdha të NP-ve në nivele të ulëta ngarkese, duke rezultuar në tableta të mëdha dhe biofilma të trashë që nuk janë të përshtatshëm për aplikime orale. Prandaj, NP-të e dehidratuara me ngarkesë të lartë insuline janë shumë të dëshirueshme. Rezultatet tona sugjerojnë që ngarkesa e lartë e insulinës së NP-ve të thara me spërkatje pa manitol mund të ofrojë shumë avantazhe tërheqëse për këto metoda alternative të administrimit.
Të gjitha NP-të e dehidratuara u mbajtën në frigorifer për tre muaj. Rezultatet e SEM treguan se morfologjia e të gjitha NP-ve të dehidratuara nuk ndryshoi ndjeshëm gjatë ruajtjes tremujore (Fig. 4). Pas rikonstituimit në ujë, të gjitha NP-të treguan një rënie të lehtë të EE-së dhe lëshuan afërsisht një sasi të vogël (~5%) të insulinës gjatë periudhës tremujore të ruajtjes (Tabela 2). Megjithatë, madhësia mesatare e grimcave të të gjitha nanopjesëzave u rrit. Madhësia e grimcave të NP-ve të thara me spërkatje pa manitol u rrit në 525 nm, ndërsa ajo e NP-ve të thara me spërkatje dhe të ngrirë me manitol u rrit në 872 dhe 921 nm, përkatësisht (Tabela 2).
Morfologjia e NP-ve të ndryshme të insulinës së dehidratuar të ruajtura për tre muaj: (a) Imazh SEM i NP-ve të insulinës së liofilizuar me manitol; (b) Imazh SEM i nanopjesëzave të insulinës të thara me spraj pa manitol; (c) pa manitol Imazhe SEM të NP-ve të insulinës të thara me spraj pa manitol.
Për më tepër, u panë precipitate në nanopjesëzat e rikonstituuara të insulinës të thara me spërkatje me manitol dhe të ngrira (Fig. S2). Kjo mund të shkaktohet nga grimca të mëdha që nuk pezullohen siç duhet në ujë. Të gjitha rezultatet e mësipërme tregojnë se teknika e tharjes me spërkatje mund të mbrojë nanopjesëzat e insulinës nga dehidratimi dhe se ngarkesa të larta të nanopjesëzave të insulinës mund të merren pa asnjë mbushës ose krioprotektiv.
Mbajtja e insulinës u testua në një mjedis me pH = 2.5 me pepsinë, tripsinë dhe α-kimotripsinë për të demonstruar aftësinë mbrojtëse të NP-ve kundër tretjes enzimatike pas dehidrimit. Mbajtja e insulinës së NP-ve të dehidratuara u krahasua me atë të NP-ve të përgatitura fllad, dhe insulina e lirë u përdor si kontroll negativ. Në këtë studim, insulina e lirë tregoi eliminim të shpejtë të insulinës brenda 4 orëve në të tre trajtimet enzimatike (Fig. 5a-c). Në të kundërt, testimi i eliminimit të insulinës së NP-ve të thara me ngrirje me manitol dhe NP-ve të thara me spërkatje me ose pa manitol tregoi mbrojtje dukshëm më të lartë të këtyre NP-ve kundër tretjes enzimatike, e cila ishte e ngjashme me atë të NP-ve të insulinës të përgatitura fllad (figura 1).5a-c). Me ndihmën e nanopjesëzave në pepsinë, tripsinë dhe α-kimotripsinë, më shumë se 50%, 60% dhe 75% e insulinës mund të mbrohej brenda 4 orëve, përkatësisht (Fig. 5a-c). Kjo aftësi mbrojtëse ndaj insulinës mund të rrisë mundësinë e thithjes më të lartë të insulinës në qarkullimin e gjakut25. Këto rezultate sugjerojnë që tharja me spërkatje me ose pa manitol dhe tharja me ngrirje me manitol mund të ruajë aftësinë mbrojtëse ndaj insulinës të NP-ve pas dehidratimit.
Mbrojtja dhe sjellja e çlirimit të NP-ve të insulinës së dehidratuar: (a) mbrojtja e insulinës në tretësirën e pepsinës; (b) mbrojtja e insulinës në tretësirën e tripsinës; (c) mbrojtja e insulinës nga tretësira e α-kimotripsinës; (d) Sjellja e çlirimit të NP-ve të dehidratuara në tretësirë ​​pH = 2.5; (e) sjellja e çlirimit të NP-ve të dehidratuara në tretësirë ​​pH = 6.6; (f) sjellja e çlirimit të NP-ve të dehidratuara në tretësirë ​​pH = 7.0.
NP-të e insulinës së thatë të përgatitura dhe të rikonstituuara fllad u inkubuan në tampona të ndryshëm (pH = 2.5, 6.6, 7.0) në 37 °C, duke simuluar mjedisin e pH-it të stomakut, duodenit dhe zorrës së hollë të sipërme, për të shqyrtuar efektin e insulinës në rezistencën ndaj insulinës. Sjellja e çlirimit në mjedise të ndryshme. Fragment i traktit gastrointestinal. Në pH = 2.5, NP-të e ngarkuara me insulinë dhe NP-të e insulinës së thatë të ritretur treguan një çlirim fillestar me shpërthim brenda orës së parë, e ndjekur nga një çlirim i ngadaltë gjatë 5 orëve të ardhshme (Fig. 5d). Ky çlirim i shpejtë në fillim ka shumë të ngjarë të jetë rezultat i desorbimit të shpejtë sipërfaqësor të molekulave të proteinave që nuk janë të imobilizuara plotësisht në strukturën e brendshme të grimcës. Në pH = 6.5, NP-të e ngarkuara me insulinë dhe NP-të e insulinës së thatë të rikonstituuara treguan një çlirim të butë dhe të ngadaltë gjatë 6 orëve, pasi pH i tretësirës së testimit ishte i ngjashëm me atë të tretësirës së përgatitur me NP (Fig. 5e). Në pH = 7, NP-të ishin të paqëndrueshme dhe pothuajse u dekompozuan plotësisht brenda dy orëve të para (Fig. 5f). Kjo ndodh sepse deprotonimi i kitosanit ndodh në pH më të lartë, gjë që rezulton në një rrjet polimer më pak kompakt dhe çlirim të insulinës së ngarkuar.
Për më tepër, NP-të e insulinës të thara me spraj pa manitol treguan një profil çlirimi më të shpejtë sesa NP-të e tjera të dehidratuara (Fig. 5d-f). Siç është përshkruar më parë, NP-të e rikonstituuara të insulinës të thara pa manitol treguan madhësinë më të vogël të grimcave. Grimcat e vogla ofrojnë një sipërfaqe më të madhe, kështu që pjesa më e madhe e ilaçit përkatës do të jetë në ose afër sipërfaqes së grimcave, duke rezultuar në çlirim të shpejtë të ilaçit26.
Citotoksiciteti i NP-ve u hetua me anë të analizës MTT. Siç tregohet në Figurën S4, të gjitha NP-të e dehidratuara nuk kishin efekt të rëndësishëm në qëndrueshmërinë e qelizave në përqendrime prej 50-500 μg/ml, duke sugjeruar që të gjitha NP-të e dehidratuara mund të përdoren në mënyrë të sigurt për të arritur dritaren terapeutike.
Mëlçia është organi kryesor përmes të cilit insulina ushtron funksionet e saj fiziologjike. Qelizat HepG2 janë një linjë qelizash hepatome njerëzore që përdoret zakonisht si një model i thithjes in vitro të hepatociteve. Këtu, qelizat HepG2 u përdorën për të vlerësuar thithjen qelizore të NP-ve të dehidratuara duke përdorur metoda të tharjes me ngrirje dhe tharjes me spërkatje. Thithja qelizore me anë të skanimit me lazer konfokal duke përdorur citometrinë me rrjedhje dhe shikimin pas disa orësh inkubimi me insulinë të lirë FITC në një përqendrim prej 25 μg/mL, NP-ve të ngarkuara me insulinë FITC të përgatitura fllad dhe NP-ve të ngarkuara me insulinë FITC të dehidratuara në përqendrime të barabarta të insulinës. U kryen vëzhgime me mikroskopinë sasiore (CLSM). NP-të e liofilizuara pa manitol u shkatërruan gjatë dehidratimit dhe nuk u vlerësuan në këtë test. Intensitetet e fluoreshencës intraqelizore të NP-ve të ngarkuara me insulinë të përgatitura fllad, NP-ve të liofilizuara me manitol dhe NP-ve të thara me spërkatje me dhe pa manitol (Fig. 6a) ishin 4.3, 2.6, 2.4 dhe 4.1 herë më të larta se ato të lira. Grupi FITC-insulinë, përkatësisht (Fig. 6b). Këto rezultate sugjerojnë që insulina e kapsuluar është më e fuqishme në thithjen qelizore sesa insulina e lirë, kryesisht për shkak të madhësisë më të vogël të nanopjesëzave të ngarkuara me insulinë të prodhuara në studim.
Thithja e qelizave HepG2 pas inkubacionit 4-orësh me NP të përgatitura fllad dhe NP të dehidratuara: (a) Shpërndarja e thithjes së insulinës FITC nga qelizat HepG2. (b) Mesatarja gjeometrike e intensiteteve të fluoreshencës e analizuar me anë të citometrisë me rrjedhje (n = 3), *P < 0.05 krahasuar me insulinën e lirë.
Po kështu, imazhet CLSM treguan se intensitetet e fluoreshencës FITC të NP-ve të ngarkuara me insulinë FITC të përgatitura fllad dhe NP-ve të thara me spraj të ngarkuara me insulinë FITC (pa manitol) ishin shumë më të forta se ato të mostrave të tjera (Fig. 6a). Për më tepër, me shtimin e manitolit, viskoziteti më i lartë i tretësirës rriti rezistencën ndaj thithjes qelizore, duke rezultuar në uljen e përhapjes së insulinës. Këto rezultate sugjerojnë që NP-të e thara me spraj pa manitol shfaqën efikasitetin më të lartë të thithjes qelizore sepse madhësia e grimcave të tyre ishte më e vogël se ajo e NP-ve të ngrirë-thara pas ri-tretjes.
Kitosani (pesha molekulare mesatare 100 KDa, 75–85% i deacetiluar) u ble nga Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanada). Tripolifosfati i natriumit (TPP) u ble nga VWR (Radnor, Pensilvani, SHBA). Insulina njerëzore rekombinante e përdorur në këtë studim ishte nga Fisher Scientific (Waltham, MA, SHBA). Insulina njerëzore e shënuar me fluoresceinë izotiocianat (FITC) dhe dihidrokloruri 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) u blenë nga Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanada). Linja qelizore HepG2 u mor nga ATCC (Manassas, Virginia, SHBA). Të gjithë reagentët e tjerë ishin të gradës analitike ose kromatografike.
Përgatitni një tretësirë ​​CS 1 mg/ml duke e tretur atë në ujë të distiluar dy herë (ujë DD) që përmban 0.1% acid acetik. Përgatitni tretësira 1 mg/ml të TPP dhe insulinës duke i tretur ato në ujë DD dhe 0.1% acid acetik, përkatësisht. Para-emulsioni u përgatit me një homogjenizues me shpejtësi të lartë polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, SHBA). Procesi i përgatitjes është si më poshtë: së pari, 2 ml tretësirë ​​TPP shtohet në 4 ml tretësirë ​​insuline, dhe përzierja përzihet për 30 minuta dhe përzihet plotësisht. Pastaj, tretësira e përzier u shtua me pika në tretësirën CS përmes një shiringe nën nxitje me shpejtësi të lartë (10,000 rpm). Përzierjet u mbajtën nën nxitje me shpejtësi të lartë (15,000 rpm) në një banjë akulli për 30 minuta, dhe ato u rregulluan në një pH të caktuar për të marrë NP të insulinës të lidhura kryq. Për të homogjenizuar më tej dhe për të zvogëluar madhësinë e grimcave të NP të insulinës, ato u sonicuan për 30 minuta shtesë. në një banjë akulli duke përdorur një sonifikues të tipit sondë (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Gjermani).
Insulinat NPS u testuan për diametrin mesatar Z, indeksin e polidispersitetit (PDI) dhe potencialin zeta duke përdorur matje dinamike të shpërndarjes së dritës (DLS) duke përdorur një Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Austri) duke i holluar ato në ujë DD në 25°C. Morfologjia dhe shpërndarja e madhësisë u karakterizuan nga një mikroskop elektronik transmetues (TEM) Hitachi H7600 (Hitachi, Tokio, Japoni), dhe imazhet u analizuan më pas duke përdorur softuerin e imazherisë Hitachi (Hitachi, Tokio, Japoni). Për të vlerësuar efikasitetin e enkapsulimit (EE) dhe kapacitetin e ngarkimit (LC) të insulinave NP, NP-të u pipetuan në tuba ultrafiltrimi me një kufi peshe molekulare prej 100 kDa dhe u centrifuguan në 500 xg për 30 minuta. Insulina e paenkapsuluar në filtrat u përcaktua sasiore duke përdorur një sistem HPLC të serisë Agilent 1100 (Agilent, Santa Clara, Kaliforni, SHBA) i përbërë nga një pompë kuaternare, automompler, ngrohës kolone dhe Detektor DAD. Insulina u analizua nga një kolonë C18 (Zorbax, 3.5 μm, 4.6 mm × 150 mm, Agilent, SHBA) dhe u zbulua në 214 nm. Faza mobile ishte acetonitril dhe ujë, që përmbante 0.1% TFA, raporte gradienti nga 10/90 në 100/0, dhe u vu në punë për 10 minuta. Faza mobile u pompua me një shpejtësi rrjedhjeje prej 1.0 ml/min. Temperatura e kolonës u vendos në 20 °C. Llogaritni përqindjet e EE dhe LC duke përdorur ekuacionet (1) dhe Ekuacionin (2).
Raporte të ndryshme CS/insulinë që varionin nga 2.0 në 4.0 u testuan për të optimizuar NP-të e insulinës. Sasi të ndryshme të tretësirës CS u shtuan gjatë përgatitjes, ndërsa përzierja insulinë/TPP u mbajt konstante. NP-të e insulinës u përgatitën në diapazonin e pH-it nga 4.0 në 6.5 duke kontrolluar me kujdes pH-in e përzierjes pas shtimit të të gjitha tretësirave (insulinë, TPP dhe CS). EE dhe madhësia e grimcave të nanopjesëzave të insulinës u vlerësuan në vlera të ndryshme të pH-it dhe raporte të ndryshme të masës CS/insulinë për të optimizuar formimin e NP-ve të insulinës.
NP-të e optimizuara të insulinës u vendosën në enën e aluminit dhe u mbuluan me një pecetë të shtrënguar me pak shirit ngjitës. Më pas, enët e vidhosura u vendosën në një tharëse ngrirjeje Labconco FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, SHBA) të pajisur me një tharëse tabakaje. Temperatura dhe presioni i vakumit u vendosën në -10 °C, 0.350 Torr për 2 orët e para dhe 0 °C dhe 0.120 Torr për 22 orët e mbetura të 24 orëve për të marrë NP-të e insulinës së thatë.
Për të gjeneruar insulinë të kapsuluar u përdor tharësja Buchi Mini Spray Tharëse B-290 (BÜCHI, Flawil, Zvicër). Parametrat e zgjedhur të tharjes ishin: temperatura 100 °C, rrjedha e furnizimit 3 L/min dhe rrjedha e gazit 4 L/min.
Nanopartikulat e insulinës para dhe pas dehidratimit u karakterizuan duke përdorur spektroskopinë FTIR-ATR. Nanopjesëzat e dehidratuara, si dhe insulina e lirë dhe kitosan u analizuan duke përdorur një spektrofotometër Spectrum 100 FTIR (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, SHBA) të pajisur me një aksesor universal për marrjen e mostrave ATR (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, SHBA). Mesataret e sinjaleve u morën nga 16 skanime me një rezolucion prej 4 cm2 në diapazonin e frekuencave 4000-600 cm2.
Morfologjia e NP-ve të insulinës së thatë u vlerësua me anë të imazheve SEM të NP-ve të insulinës të ngrirë-thara dhe të thara me spërkatje, të kapura nga një Mikroskop Elektronik Skanues me Rreze Jonike të Fokusuar Helios NanoLab 650 (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, SHBA). Parametri kryesor i përdorur ishte tensioni 5 keV dhe rryma 30 mA.
Të gjitha NP-të e insulinës së dehidratuar u rizretën në ujë të valë. Madhësia e grimcave, PDI, EE dhe LC u testuan përsëri duke përdorur të njëjtën metodë të përmendur më parë për të vlerësuar cilësinë e tyre pas dehidratimit. Stabiliteti i NP-ve të anhidroinsulinës u mat gjithashtu duke testuar vetitë e NP-ve pas ruajtjes së zgjatur. Në këtë studim, të gjitha NP-të pas dehidratimit u ruajtën në frigorifer për tre muaj. Pas tre muajsh ruajtjeje, NP-të u testuan për madhësinë morfologjike të grimcave, PDI, EE dhe LC.
Tretni 5 mL të NP-ve të rikonstituuara në 45 mL që përmbajnë lëng gastrik të simuluar (pH 1.2, që përmban 1% pepsinë), lëng intestinal (pH 6.8, që përmban 1% tripsinë) ose tretësirë ​​kimotripsine (100 g/mL, në tampon fosfati, pH 7.8) për të vlerësuar efikasitetin e insulinës në mbrojtjen e NP-ve pas dehidratimit. Ato u inkubuan në 37°C me shpejtësi agjitimi prej 100 rpm. 500 μL të tretësirës u mblodhën në pika të ndryshme kohore dhe përqendrimi i insulinës u përcaktua me HPLC.
Sjellja e çlirimit in vitro të NP-ve të insulinës të përgatitura fllad dhe të dehidratuara u testua me metodën e qeses së dializës (kufiri i peshës molekulare 100 kDa, Spectra Por Inc.). NP-të e thata të përgatitura fllad dhe të rikonstituuara u dializuan në lëngje në pH 2.5, pH 6.6 dhe pH 7.0 (tretësirë ​​fiziologjike e tamponuar me fosfat 0.1 M, PBS) për të simuluar mjedisin e pH-it të stomakut, duodenit dhe zorrës së hollë të sipërme, përkatësisht. Të gjitha mostrat u inkubuan në 37 °C me tundje të vazhdueshme në 200 rpm. Aspironi lëngun jashtë qeses së dializës 5 mL në kohët e mëposhtme: 0.5, 1, 2, 3, 4 dhe 6 orë dhe menjëherë rimbushni vëllimin me dializat të freskët. Kontaminimi i insulinës në lëng u analizua me HPLC dhe shkalla e çlirimit të insulinës nga nanopjesëzat u llogarit nga raporti i insulinës së lirë të çliruar me insulinën totale të kapsuluar në nanopjesëza (Ekuacioni 3).
Linja qelizore e karcinomës hepatocelulare njerëzore, qelizat HepG2, u rritën në enë me diametër 60 mm duke përdorur Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) që përmbante 10% serum fetal të gjedhit, 100 IU/mL penicilinë dhe 100 μg/mL streptomicinë29. Kulturat u mbajtën në 37°C, lagështi relative 95% dhe 5% CO2. Për analizat e thithjes, qelizat HepG2 u mbjellën në 1 × 105 qeliza/ml në një sistem rrëshqitës me dhomë Nunc Lab-Tek me 8 puseta (Thermo Fisher, NY, SHBA). Për analizat e citotoksicitetit, ato u mbjellën në pllaka me 96 puseta (Corning, NY, SHBA) me një dendësi prej 5 × 104 qeliza/ml.
Analiza MTT u përdor për të vlerësuar citotoksicitetin e NP-ve të insulinës të përgatitura fllad dhe të dehidratuara30. Qelizat HepG2 u mbjellën në pllaka me 96 puseta me një dendësi prej 5 × 104 qeliza/mL dhe u kultivuan për 7 ditë para testimit. NP-të e insulinës u holluan në përqendrime të ndryshme (50 deri në 500 μg/mL) në medium kulture dhe më pas u administruan në qeliza. Pas 24 orësh inkubimi, qelizat u lanë 3 herë me PBS dhe u inkubuan me medium që përmbante 0.5 mg/ml MTT për 4 orë të tjera. Citotoksiciteti u vlerësua duke matur reduktimin enzimatik të MTT-së së tetrazoliumit të verdhë në formazan të purpurt në 570 nm duke përdorur një lexues pllakash spektrofotometrik Tecan infinite M200 pro (Tecan, Männedorf, Zvicër).
Efikasiteti i thithjes qelizore të NP-ve u testua me anë të mikroskopisë skanuese me lazer konfokal dhe analizës së citometrisë me rrjedhje. Çdo pus i sistemit të rrëshqitjes me dhomë Nunc Lab-Tek u trajtua me FITC-insulinë të lirë, NP të ngarkuara me FITC-insulinë dhe u rikonstituuan 25 μg/mL NP të FITC-insulinës së dehidratuar në të njëjtin përqendrim dhe u inkubuan për 4 orë. Qelizat u lanë 3 herë me PBS dhe u fiksuan me 4% paraformaldehidë. Bërthamat u ngjyrosën me 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Lokalizimi i insulinës u vu re duke përdorur një mikroskop konfokal skanues me lazer/dy foton Olympus FV1000 (Olympus, Shinjuku City, Tokio, Japoni). Për analizën e citometrisë me rrjedhje, u shtuan të njëjtat përqendrime të 10 μg/mL FITC-insulinë të lirë, NP të ngarkuara me FITC-insulinë dhe NP të FITC-insulinës së dehidratuar të ritretur. Pllaka me 96 puseta u mbjellën me qeliza HepG2 dhe u inkubuan për 4 orë. Pas 4 orësh inkubimi, qelizat u hoqën dhe u lanë 3 herë me FBS. 5 × 104 qeliza për mostër u analizuan me një citometër rrjedhës BD LSR II (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Shtetet e Bashkuara).
Të gjitha vlerat shprehen si mesatare ± devijim standard. Krahasimet midis të gjitha grupeve u vlerësuan duke përdorur ANOVA me një drejtim ose testin t nga IBM SPSS Statistics 26 për Mac (IBM, Endicott, New York, SHBA) dhe p < 0.05 u konsiderua statistikisht e rëndësishme.
Ky studim demonstron fleksibilitetin dhe aftësinë e tharjes me sprej për të dehidratuar nanopjesëzat e kitosanit/TPP/insulinës të lidhura në mënyrë të kryqëzuar me një rikonstituim më të mirë krahasuar me metodat standarde të tharjes me ngrirje duke përdorur agjentë mbushës ose krioprojektë me kapacitet dhe kapacitet më të lartë ngarkese. Nanopjesëzat e optimizuara të insulinës dhanë një madhësi mesatare të grimcave prej 318 nm dhe një efikasitet enkapsulimi prej 99.4%. Rezultatet e SEM dhe FTIR pas dehidratimit treguan se struktura sferike u ruajt vetëm në NP-të e thara me sprej me dhe pa manitol dhe të liofilizuara me manitol, por NP-të e liofilizuara pa manitol u dekompozuan gjatë dehidratimit. Në testin e aftësisë së rikonstituimit, nanopjesëzat e insulinës të thara me sprej pa manitol treguan madhësinë mesatare më të vogël të grimcave dhe ngarkesën më të lartë pas rikonstituimit. Sjelljet e çlirimit të të gjitha këtyre NP-ve të dehidratuara treguan se ato u çliruan shpejt në tretësira me pH = 2.5 dhe pH = 7, dhe shumë të qëndrueshme në tretësirë ​​me pH = 6.5. Krahasuar me NP-të e tjera të dehidratuara të ritretura, NP-të e thara me spraj pa manitol treguan çlirimin më të shpejtë. Ky rezultat është në përputhje me atë të vërejtur në analizën e përthithjes qelizore, pasi NP-të e thara me spraj në mungesë të manitolit pothuajse plotësisht ruajtën efikasitetin e përthithjes qelizore të NP-ve të përgatitura fllad. Këto rezultate sugjerojnë që nanopjesëzat e thata të insulinës të përgatitura me tharje me spraj pa manitol janë më të përshtatshmet për përpunim të mëtejshëm në forma të tjera dozimi anhidrike, të tilla si tableta orale ose filma bioadeziv.
Për shkak të çështjeve të pronësisë intelektuale, të dhënat e gjeneruara dhe/ose të analizuara gjatë studimit aktual nuk janë të disponueshme publikisht, por janë të disponueshme nga autorët përkatës me kërkesë të arsyeshme.
Kagan, A. Diabeti i tipit 2: origjina sociale dhe shkencore, ndërlikimet mjekësore dhe implikimet për pacientët dhe të tjerët. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. & Jiang, P. Zhvillimi i enkapsulimit të insulinës: a është administrimi oral tani i mundur? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. & Dass, CR Përparimet e fundit në sistemet orale të administrimit të lipozomeve të ngarkuara me insulinë për trajtimin e diabetit. Interpretim. J. Pharmacy.549, 201–217 (2018).