Faleminderit që vizituat Nature.com. Versioni i shfletuesit që po përdorni ka mbështetje të kufizuar CSS. Për rezultate më të mira, ne ju rekomandojmë të përdorni një version më të ri të shfletuesit tuaj (ose të çaktivizoni Modalitetin e Përputhshmërisë në Internet Explorer). Ndërkohë, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne po e shfaqim faqen pa stilizim ose JavaScript.
Acidi propionik (PPA) përdoret për të studiuar rolin e mosfunksionimit mitokondrial në çrregullimet neurozhvillimore siç është çrregullimi i spektrit të autizmit. PPA dihet se prish biogjenezën, metabolizmin dhe qarkullimin mitokondrial. Megjithatë, efektet e PPA në dinamikën mitokondriale, ndarjen dhe bashkimin mbeten problematike për shkak të natyrës komplekse kohore të këtyre mekanizmave. Këtu, ne përdorim teknika plotësuese të imazherisë sasiore për të hetuar se si PPA ndikon në ultrastrukturën mitokondriale, morfologjinë dhe dinamikën në qelizat SH-SY5Y të ngjashme me neuronet. PPA (5 mM) shkaktoi një rënie të konsiderueshme në zonën mitokondriale (p < 0.01), diametrin dhe perimetrin e Feret (p < 0.05) dhe zonën 2 (p < 0.01). Analiza e lokatorit të ngjarjeve mitokondriale tregoi një rritje të konsiderueshme (p < 0.05) në ngjarjet e ndarjes dhe bashkimit, duke ruajtur kështu integritetin e rrjetit mitokondrial në kushte stresi. Përveç kësaj, shprehja e ARNi-së së cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) dhe OPA1 (p < 0.05) u zvogëlua ndjeshëm. 01). Kjo ilustron rimodelimin e morfologjisë mitokondriale, biogjenezës dhe dinamikës për të ruajtur funksionin në kushte stresi. Të dhënat tona ofrojnë një pasqyrë të re mbi efektet e PPA-së në dinamikën mitokondriale dhe nxjerrin në pah dobinë e teknikave të imazherisë për të studiuar mekanizmat kompleksë rregullatorë të përfshirë në përgjigjet mitokondriale ndaj stresit.
Mitokondritë janë pjesëmarrëse integrale në një sërë funksionesh qelizore përtej roleve të tyre tipike në prodhimin e energjisë dhe biosintezën. Metabolizmi mitokondrial është një rregullator kyç i sinjalizimit të kalciumit, homeostazës metabolike dhe redoks, sinjalizimit inflamator, modifikimeve epigjenetike, përhapjes qelizore, diferencimit dhe vdekjes së programuar qelizore1. Në veçanti, metabolizmi mitokondrial është kritik për zhvillimin, mbijetesën dhe funksionin neuronal dhe është i përfshirë gjerësisht në manifestime të ndryshme të neuropatologjisë2,3,4.
Gjatë dekadës së fundit, gjendja metabolike është shfaqur si një rregullator qendror i neurogjenezës, diferencimit, maturimit dhe plasticitetit5,6. Kohët e fundit, morfologjia dhe dinamika mitokondriale janë bërë komponentë veçanërisht të rëndësishëm të mitozës, një proces dinamik që mban një grup mitokondrish të shëndetshme brenda qelizave. Dinamika mitokondriale rregullohet nga rrugë komplekse të ndërvarura që variojnë nga biogjeneza mitokondriale dhe bioenergjetika deri te ndarja, bashkimi, transporti dhe pastrimi mitokondrial7,8. Ndërprerja e ndonjërit prej këtyre mekanizmave integrues dëmton mirëmbajtjen e rrjeteve të shëndetshme mitokondriale dhe ka pasoja të thella funksionale për neurozhvillimin9,10. Në të vërtetë, çrregullimi i dinamikës mitokondriale vërehet në shumë çrregullime psikiatrike, neurodegjenerative dhe neurozhvilluese, duke përfshirë çrregullimet e spektrit të autizmit (ASD)11,12.
Çrregullimi i Spektrit Autik (ÇSA) është një çrregullim heterogjen neuro-zhvillues me një arkitekturë komplekse gjenetike dhe epigjenetike. Trashëgimia e ÇSA-së është e padiskutueshme, por etiologjia themelore molekulare mbetet e pakuptuar. Të dhënat e grumbulluara nga modelet paraklinike, studimet klinike dhe të dhënat molekulare multi-omike ofrojnë prova në rritje të mosfunksionimit mitokondrial në ÇSA13,14. Ne më parë kryem një shqyrtim të metilimit të ADN-së në të gjithë gjenomin në një grup pacientësh me ÇSA dhe identifikuam gjene të metiluara në mënyrë të ndryshme të grumbulluara përgjatë shtigjeve metabolike mitokondriale15. Më pas raportuam metilimin diferencial të rregullatorëve qendrorë të biogjenezës dhe dinamikës mitokondriale, i cili shoqërohej me rritjen e numrit të kopjeve të ADN-së së mt dhe profilin metabolik urinar të ndryshuar në ÇSA16. Të dhënat tona ofrojnë prova në rritje se dinamika mitokondriale dhe homeostaza luajnë një rol qendror në patofiziologjinë e ÇSA-së. Prandaj, përmirësimi i kuptimit mekanik të marrëdhënies midis dinamikës mitokondriale, morfologjisë dhe funksionit është një qëllim kyç i hulumtimeve të vazhdueshme mbi sëmundjet neurologjike të karakterizuara nga mosfunksionimi sekondar mitokondrial.
Teknikat molekulare përdoren shpesh për të studiuar rolin e gjeneve specifike në përgjigjet ndaj stresit mitokondrial. Megjithatë, kjo qasje mund të jetë e kufizuar nga natyra shumëplanëshe dhe kohore e mekanizmave të kontrollit mitotik. Për më tepër, shprehja diferenciale e gjeneve mitokondriale është një tregues indirekt i ndryshimeve funksionale, veçanërisht pasi vetëm një numër i kufizuar gjenesh analizohen zakonisht. Prandaj, janë propozuar metoda më të drejtpërdrejta për të studiuar funksionin mitokondrial dhe bioenergjetikën17. Morfologjia mitokondriale është e lidhur ngushtë me dinamikën mitokondriale. Forma, lidhshmëria dhe struktura mitokondriale janë kritike për prodhimin e energjisë dhe mbijetesën mitokondriale dhe qelizore5,18. Për më tepër, komponentët e ndryshëm të mitozës përqendrohen në ndryshimet në morfologjinë mitokondriale, të cilat mund të shërbejnë si pika fundore të dobishme të mosfunksionimit mitokondrial dhe të ofrojnë një bazë për studime të mëvonshme mekanike.
Morfologjia mitokondriale mund të vëzhgohet drejtpërdrejt duke përdorur mikroskopinë elektronike të transmetimit (TEM), duke lejuar studim të detajuar të ultrastrukturës qelizore. TEM vizualizon drejtpërdrejt morfologjinë, formën dhe strukturën e kristeve mitokondriale në rezolucionin e mitokondrive individuale, në vend që të mbështetet vetëm në transkriptimin e gjeneve, shprehjen e proteinave ose parametrat funksionalë mitokondrialë në popullatat qelizore17,19,20. Përveç kësaj, TEM lehtëson studimin e ndërveprimeve midis mitokondrive dhe organeleve të tjera, siç janë retikuli endoplazmatik dhe autofagozomet, të cilat luajnë role kyçe në funksionin mitokondrial dhe homeostazën21,22. Kështu, kjo e bën TEM një pikënisje të mirë për të studiuar mosfunksionimin mitokondrial përpara se të përqendrohemi në rrugë ose gjene specifike. Ndërsa funksioni mitokondrial bëhet gjithnjë e më i rëndësishëm për neuropatologjinë, ekziston një nevojë e qartë për të qenë në gjendje të studiojmë drejtpërdrejt dhe në mënyrë sasiore morfologjinë dhe dinamikën mitokondriale në modelet neuronale in vitro.
Në këtë artikull, ne shqyrtojmë dinamikën mitokondriale në një model neuronal të mosfunksionimit mitokondrial në çrregullimin e spektrit të autizmit. Më parë kemi raportuar metilim diferencial të propionil-CoA karboksilazës beta (PCCB) në ASD15, një nënnjësi e enzimës PCC të propionil-CoA karboksilazës mitokondriale. Dihet që çrregullimi i PCC shkakton akumulim toksik të derivateve të propionilit, duke përfshirë acidin propionik (PPA)23,24,25. PPA është treguar se prish metabolizmin neuronal dhe ndryshon sjelljen in vivo dhe është një model i vendosur shtazor për studimin e mekanizmave neurozhvillimorë të përfshirë në ASD26,27,28. Përveç kësaj, PPA është raportuar se prish potencialin e membranës mitokondriale, biogjenezën dhe frymëmarrjen in vitro dhe është përdorur gjerësisht për të modeluar mosfunksionimin mitokondrial në neurone29,30. Megjithatë, ndikimi i mosfunksionimit mitokondrial të shkaktuar nga PPA në morfologjinë dhe dinamikën mitokondriale mbetet i kuptuar dobët.
Ky studim përdor teknika plotësuese të imazherisë për të përcaktuar efektet e PPA-së në morfologjinë, dinamikën dhe funksionin mitokondrial në qelizat SH-SY5Y. Së pari, ne zhvilluam një metodë TEM për të vizualizuar ndryshimet në morfologjinë dhe ultrastrukturën mitokondriale17,31,32. Duke pasur parasysh natyrën dinamike të mitokondrive33, ne përdorëm gjithashtu analizën e lokalizuesit të ngjarjeve mitokondriale (MEL) për të përcaktuar ndryshimet në ekuilibrin midis ngjarjeve të ndarjes dhe bashkimit, numrit dhe vëllimit mitokondrial nën stresin e PPA-së. Së fundmi, ne shqyrtuam nëse morfologjia dhe dinamika mitokondriale shoqërohen me ndryshime në shprehjen e gjeneve të përfshira në biogjenezë, ndarje dhe bashkim. Të marra së bashku, të dhënat tona ilustrojnë sfidën e sqarimit të kompleksitetit të mekanizmave që rregullojnë dinamikën mitokondriale. Ne theksojmë dobinë e TEM në studimin e morfologjisë mitokondriale si një pikë fundore konvergjente e matshme e mitozës në qelizat SH-SY5Y. Përveç kësaj, ne theksojmë se të dhënat TEM ofrojnë informacionin më të pasur kur kombinohen me teknikat e imazherisë që kapin gjithashtu ngjarjet dinamike në përgjigje të stresit metabolik. Karakterizimi i mëtejshëm i mekanizmave rregullatorë molekularë që mbështesin mitozën e qelizave neuronale mund të ofrojë një pasqyrë të rëndësishme të komponentit mitokondrial të sistemit nervor dhe sëmundjeve neurodegjenerative.
Për të nxitur stresin mitokondrial, qelizat SH-SY5Y u trajtuan me PPA duke përdorur 3 mM dhe 5 mM propionat natriumi (NaP). Para TEM, mostrat iu nënshtruan përgatitjes kriogjenike të mostrës duke përdorur ngrirje dhe ngrirje me presion të lartë (Fig. 1a). Ne zhvilluam një tubacion të automatizuar të analizës së imazhit mitokondrial për të matur tetë parametra morfologjikë të popullatave mitokondriale në tre replikime biologjike. Ne zbuluam se trajtimi me PPA ndryshoi ndjeshëm katër parametra: zona 2, zona, perimetri dhe diametri i Feret (Fig. 1b-e). Sipërfaqja 2 u ul ndjeshëm me trajtimin me PPA 3 mM dhe 5 mM (p = 0.0183 dhe p = 0.002, përkatësisht) (Fig. 1b), ndërsa zona (p = 0.003), perimetri (p = 0.0106) dhe diametri i Feret janë ulur ndjeshëm. Pati një reduktim të ndjeshëm (p = 0.0172) në grupin e trajtimit 5 mM krahasuar me grupin e kontrollit (Fig. 1c-e). Ulje të ndjeshme në sipërfaqe dhe perimetër treguan se qelizat e trajtuara me 5 mM PPA kishin mitokondri më të vogla dhe më të rrumbullakosura, dhe se këto mitokondri ishin më pak të zgjatura se ato në qelizat kontrolluese. Kjo është gjithashtu në përputhje me një rënie të ndjeshme në diametrin Feret, një parametër i pavarur që tregon një rënie në distancën më të madhe midis skajeve të grimcave. U vunë re ndryshime në ultrastrukturën e kristeve: kristeve u bënë më pak të theksuara nën ndikimin e stresit të PPA (Fig. 1a, paneli B). Megjithatë, jo të gjitha imazhet pasqyruan qartë ultrastrukturën e kristeve, kështu që nuk u krye një analizë sasiore e këtyre ndryshimeve. Këto të dhëna TEM mund të pasqyrojnë tre skenarë të mundshëm: (1) PPA rrit ndarjen ose pengon bashkimin, duke bërë që mitokondritë ekzistuese të tkurren në madhësi; (2) biogjeneza e përmirësuar krijon mitokondri të reja, më të vogla ose (3) nxit të dy mekanizmat njëkohësisht. Edhe pse këto kushte nuk mund të dallohen nga TEM, ndryshimet e rëndësishme morfologjike tregojnë ndryshime në homeostazën dhe dinamikën mitokondriale nën stresin e PPA. Më pas ne eksploruam parametra shtesë për të karakterizuar më tej këto dinamika dhe mekanizmat e mundshëm që qëndrojnë në themel të tyre.
Acidi propionik (PPA) rimodelon morfologjinë mitokondriale. (a) Imazhe përfaqësuese të mikroskopisë elektronike të transmetimit (TEM) që tregojnë se madhësia mitokondriale zvogëlohet dhe mitokondritë bëhen më të vogla dhe më të rrumbullakëta me rritjen e trajtimit me PPA; 0 mM (të patrajtuara), 3 mM dhe 5 mM, përkatësisht. Shigjetat e kuqe tregojnë mitokondritë. (b–e) Qelizat SH-SY5Y të trajtuara me PPA për 24 orë u përgatitën për TEM dhe rezultatet u analizuan duke përdorur Fiji/ImageJ. Katër nga tetë parametrat treguan dallime të rëndësishme midis qelizave të kontrollit (të patrajtuara, 0 mM PPA) dhe qelizave të trajtuara (3 mM dhe 5 mM PPA). (b) Rajoni 2, (c) Sipërfaqja, (d) Perimetri, (e) Diametri i Feret. Analiza njëkahëshe e variancës (kontrolli kundrejt trajtimit) dhe testi i krahasimit të shumëfishtë i Dunnett u përdorën për të përcaktuar dallimet e rëndësishme (p < 0.05). Pikat e të dhënave përfaqësojnë vlerën mesatare mitokondriale për secilën qelizë individuale, dhe shiritat e gabimit përfaqësojnë mesataren ± SEM. Të dhënat e treguara përfaqësojnë n = 3, të paktën 24 qeliza për replikim; U analizuan gjithsej 266 imazhe; * tregon p < 0.05, ** tregon p < 0.01.
Për të karakterizuar më tej se si dinamika mitokondriale i përgjigjet PPA-së, ne ngjyrosëm mitokondritë me ester etil tetrametilrodamine (TMRE) dhe përdorëm mikroskopinë me interval kohor dhe analizën MEL për të lokalizuar dhe përcaktuar sasinë e mitokondrive pas 24 orësh në 3 dhe 5 mM PPA. Trajtimi i ngjarjeve të ndarjes dhe bashkimit. (Fig. 2a). Pas analizës MEL, mitokondritë u analizuan më tej për të përcaktuar sasinë e numrit të strukturave mitokondriale dhe vëllimin e tyre mesatar. Ne vumë re një rritje të vogël por domethënëse në numrin e ngjarjeve të ndarjes që ndodhën në 3 mM [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] krahasuar me ndarjen [5.6 ± 0.3 (p < 0.05)] dhe bashkimin [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] dhe bashkimin [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] 0.05)] <0.05)] ngjarjet u rritën ndjeshëm në 5 mM krahasuar me kontrollin (Fig. 3b). Numri i mitokondrive u rrit ndjeshëm si në 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] ashtu edhe në 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] (Fig. 3c), ndërsa vëllimi mesatar i secilës strukturë mitokondriale mbeti i pandryshuar (Fig. 3c). 3d). Të marra së bashku, kjo sugjeron që rimodelimi i dinamikës mitokondriale shërben si një përgjigje kompensuese që ruan me sukses integritetin e rrjetit mitokondrial. Rritja e numrit të ngjarjeve të ndarjes në 3 mM PPA sugjeron që rritja e numrit mitokondrial është pjesërisht për shkak të ndarjes mitokondriale, por duke pasur parasysh që vëllimi mesatar mitokondrial mbetet në thelb i pandryshuar, biogjeneza nuk mund të përjashtohet si një përgjigje shtesë kompensuese. Megjithatë, këto të dhëna janë në përputhje me strukturat mitokondriale më të vogla dhe të rrumbullakëta të vëzhguara nga TEM dhe gjithashtu demonstrojnë ndryshime të rëndësishme në dinamikën mitokondriale të shkaktuar nga PPA.
Acidi propionik (PPA) shkakton rimodelimin dinamik mitokondrial për të ruajtur integritetin e rrjetit. Qelizat SH-SY5Y u kultivuan, u trajtuan me 3 dhe 5 mM PPA për 24 orë dhe u ngjyrosën me TMRE dhe Hoechst 33342, e ndjekur nga analiza MEL. (a) Imazhe përfaqësuese të mikroskopisë me kalim kohe që përshkruajnë projeksione me ngjyra dhe intensitet maksimal të binarizuar në kohën 2 (t2) për secilën gjendje. Rajonet e zgjedhura të treguara në secilën imazh binar janë të përmirësuara dhe shfaqen në 3D në tre korniza kohore të ndryshme (t1-t3) për të ilustruar dinamikën me kalimin e kohës; ngjarjet e bashkimit janë të theksuara me jeshile; ngjarjet e ndarjes janë të theksuara me jeshile. Shfaqen me të kuqe. (b) Numri mesatar i ngjarjeve dinamike për gjendje. (c) Numri mesatar i strukturave mitokondriale për qelizë. (d) Vëllimi mesatar (µm3) i secilës strukturë mitokondriale për qelizë. Të dhënat e treguara janë përfaqësuese të n = 15 qelizave për grup trajtimi. Shiritat e gabimit të treguar përfaqësojnë mesataren ± SEM, shiriti i shkallës = 10 μm, * p < 0.05.
Acidi propionik (PPA) shkakton shtypjen transkriptuese të gjeneve të shoqëruara me dinamikën mitokondriale. Qelizat SH-SY5Y u trajtuan me 3 dhe 5 mM PPA për 24 orë. Kuantifikimi relativ i gjeneve u krye duke përdorur RT-qPCR dhe u normalizua në B2M. Gjenet e biogjenezës mitokondriale (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 dhe (d) NFE2L2. Gjenet e bashkimit dhe ndarjes mitokondriale (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 dhe (i) DRP1. Dallimet e rëndësishme (p < 0.05) u testuan duke përdorur ANOVA me një drejtim (kontroll kundrejt trajtimit) dhe testin e krahasimit të shumëfishtë të Dunnett: * tregon p < 0.05, ** tregon p < 0.01, dhe **** tregon p < 0.0001. Shiritat përfaqësojnë shprehjen mesatare ± SEM. Të dhënat e paraqitura përfaqësojnë n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) dhe n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) replikime biologjike.
Të dhënat nga analizat TEM dhe MEL së bashku tregojnë se PPA ndryshon morfologjinë dhe dinamikën mitokondriale. Megjithatë, këto teknika imazherie nuk ofrojnë informacion mbi mekanizmat themelorë që nxisin këto procese. Prandaj, ne shqyrtuam shprehjen e ARNi-së së nëntë rregullatorëve kryesorë të dinamikës mitokondriale, biogjenezës dhe mitozës në përgjigje të trajtimit me PPA. Ne përcaktuam sasinë e onkogjenit të mielomës qelizore (cMYC), faktorit respirator bërthamor (NRF1), faktorit 1 të transkriptimit mitokondrial (TFAM), faktorit të transkriptimit të ngjashëm me NFE2, BZIP (NFE2L2), proteinës 2 të ngjashme me gastrinë (STOML2), atrofisë 1 të nervit optik (OPA1), Mitofusinës 1 (MFN1), Mitofusinës 2 (MFN2) dhe proteinës 1 të lidhur me dinaminën (DRP1) pas 24 orësh trajtimi me 3 mM dhe 5 mM PPA. Ne vëzhguam trajtim me PPA prej 3 mM (p = 0.0053, p = 0.0415 dhe p < 0.0001, përkatësisht) dhe 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001). (Fig. 3a–c). Ulja e shprehjes së mRNA-së ishte e varur nga doza: shprehja e cMYC, NRF1 dhe TFAM u ul me 5.7, 2.6 dhe 1.9 herë në 3 mM, përkatësisht, dhe me 11.2, 3 dhe 2.2 herë në 5 mM. Në të kundërt, gjeni qendror i biogjenezës redoks NFE2L2 nuk u ndryshua në asnjë përqendrim të PPA-së, megjithëse u vu re një trend i ngjashëm i varur nga doza e uljes së shprehjes (Fig. 3d).
Ne gjithashtu shqyrtuam shprehjen e gjeneve klasike të përfshira në rregullimin e ndarjes dhe bashkimit. STOML2 mendohet të jetë i përfshirë në bashkim, mitofagji dhe biogjenezë, dhe shprehja e tij u zvogëlua ndjeshëm (p < 0.0001) me 3 mM (ndryshim 2.4-fish) dhe 5 mM (ndryshim 2.8-fish) PPA (Fig. 1). 3d). Në mënyrë të ngjashme, shprehja e gjenit të bashkimit OPA1 u zvogëlua në 3 mM (ndryshim 1.6-fish) dhe 5 mM (ndryshim 1.9-fish) PPA (p = 0.006 dhe p = 0.0024, përkatësisht) (Fig. 3f). Megjithatë, ne nuk gjetëm dallime të rëndësishme në shprehjen e gjeneve të bashkimit MFN1, MFN2 ose gjenit të ndarjes DRP1 nën stresin 24-orësh të PPA (Fig. 3g-i). Përveç kësaj, zbuluam se nivelet e katër proteinave të bashkimit dhe ndarjes (OPA1, MFN1, MFN2 dhe DRP1) nuk ndryshuan në të njëjtat kushte (Fig. 4a-d). Është e rëndësishme të theksohet se këto të dhëna pasqyrojnë një pikë të vetme në kohë dhe mund të mos pasqyrojnë ndryshime në shprehjen e proteinave ose nivelet e aktivitetit gjatë fazave të hershme të stresit të PPA-së. Megjithatë, uljet e ndjeshme në shprehjen e cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 dhe OPA1 tregojnë çrregullim të konsiderueshëm transkriptues të metabolizmit mitokondrial, biogjenezës dhe dinamikës. Përveç kësaj, këto të dhëna nxjerrin në pah dobinë e teknikave të imazherisë për të studiuar drejtpërdrejt ndryshimet në gjendjen përfundimtare të funksionit mitokondrial.
Nivelet e proteinave të faktorit të bashkimit dhe ndarjes nuk ndryshuan pas trajtimit me acid propionik (PPA). Qelizat SH-SY5Y u trajtuan me 3 dhe 5 mM PPA për 24 orë. Nivelet e proteinave u përcaktuan me anë të analizës Western blot dhe nivelet e shprehjes u normalizuan në proteina totale. Tregohen shprehja mesatare e proteinave dhe Western blot përfaqësuese të proteinës së synuar dhe asaj totale. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Shiritat përfaqësojnë mesataren ± SEM, dhe të dhënat e paraqitura janë përfaqësuese të n = 3 replikimeve biologjike. Krahasime të shumëfishta (p < 0.05) u kryen duke përdorur analizën njëkahëshe të variancës dhe testin e Dunnett. Xheli dhe bloti origjinal tregohen në Figurën S1.
Mosfunksionimi mitokondrial shoqërohet me sëmundje shumësistemore që variojnë nga sëmundjet metabolike, kardiovaskulare dhe muskulore deri te sëmundjet neurologjike1,10. Shumë sëmundje neurodegjenerative dhe neurodegjenerative shoqërohen me mosfunksionim mitokondrial, duke theksuar rëndësinë e këtyre organeleve gjatë gjithë jetëgjatësisë së trurit. Këto sëmundje përfshijnë sëmundjen e Parkinsonit, sëmundjen e Alzheimerit dhe Çrregullimin e Spektrit Autik3,4,18. Megjithatë, qasja në indet e trurit për të studiuar këto sëmundje është e vështirë, veçanërisht në nivelin mekanistik, duke i bërë sistemet model qelizore një alternativë të domosdoshme. Në këtë studim, ne përdorim një sistem modeli qelizor duke përdorur qeliza SH-SY5Y të trajtuara me PPA për të përmbledhur mosfunksionimin mitokondrial të vërejtur në sëmundjet neuronale, veçanërisht çrregullimet e spektrit të autizmit. Përdorimi i këtij modeli PPA për të studiuar dinamikën mitokondriale në neurone mund të ofrojë një pasqyrë të etiologjisë së Çrregullimit të Spektrit Autik.
Ne shqyrtuam mundësinë e përdorimit të TEM për të parë ndryshimet në morfologjinë mitokondriale. Është e rëndësishme të theksohet se TEM duhet të përdoret në mënyrë korrekte për të maksimizuar efektivitetin e saj. Përgatitja e krio-mostrave lejon ruajtjen më të mirë të strukturave neuronale duke fiksuar njëkohësisht përbërësit qelizorë dhe duke zvogëluar formimin e artefakteve34. Në përputhje me këtë, ne vumë re se qelizat SH-SY5Y të ngjashme me neuronet kishin organele nënqelizore të paprekura dhe mitokondri të zgjatura (Fig. 1a). Kjo nxjerr në pah dobinë e teknikave të përgatitjes kriogjenike për studimin e morfologjisë mitokondriale në modelet e qelizave neuronale. Megjithëse matjet sasiore janë kritike për analizën objektive të të dhënave TEM, ende nuk ka konsensus se cilat parametra specifikë duhet të maten për të konfirmuar ndryshimet morfologjike mitokondriale. Bazuar në një numër të madh studimesh që kanë shqyrtuar në mënyrë sasiore morfologjinë mitokondriale17,31,32, ne zhvilluam një tubacion të automatizuar të analizës së imazhit mitokondrial që mat tetë parametra morfologjikë, përkatësisht: sipërfaqen, sipërfaqen2, raportin e aspektit, perimetrin, rrethshmërinë, gradën, diametrin Feret dhe rrumbullakësinë.
Midis tyre, PPA uli ndjeshëm zonën 2, sipërfaqen, perimetrin dhe diametrin e Feret (Fig. 1b-e). Kjo tregoi se mitokondritë u bënë më të vogla dhe më të rrumbullakosura, gjë që është në përputhje me studimet e mëparshme që tregojnë një rënie në zonën mitokondriale pas 72 orësh stres mitokondrial të shkaktuar nga PPA30. Këto karakteristika morfologjike mund të tregojnë ndarje mitokondriale, një proces i nevojshëm për të izoluar komponentët e dëmtuar nga rrjeti mitokondrial për të nxitur degradimin e tyre përmes mitofagjisë35,36,37. Nga ana tjetër, ulja e madhësisë mesatare mitokondriale mund të shoqërohet me rritjen e biogjenezës, e cila rezulton në formimin e mitokondrive të vogla të sapolindura. Rritja e ndarjes ose biogjenezës përfaqëson një përgjigje kompensuese për të ruajtur mitozën kundër stresit mitokondrial. Megjithatë, rritja e zvogëluar mitokondriale, bashkimi i dëmtuar ose kushte të tjera nuk mund të përjashtohen.
Edhe pse imazhet me rezolucion të lartë të krijuara nga TEM lejojnë përcaktimin e karakteristikave morfologjike në nivelin e mitokondrive individuale, kjo metodë prodhon pamje dy-dimensionale në një pikë të vetme në kohë. Për të studiuar përgjigjet dinamike ndaj stresit metabolik, ne ngjyrosëm mitokondritë me TMRE dhe përdorëm mikroskopinë me interval kohor me analizën MEL, e cila lejon vizualizim 3D me rendiment të lartë të ndryshimeve në rrjetin mitokondrial me kalimin e kohës33,38. Ne vëzhguam ndryshime delikate, por domethënëse në dinamikën mitokondriale nën stresin e PPA (Fig. 2). Në 3 mM, numri i ngjarjeve të ndarjes u rrit ndjeshëm, ndërsa ngjarjet e bashkimit mbetën të njëjta si në kontrollin. Një rritje në numrin e ngjarjeve të ndarjes dhe bashkimit u vu re në 5 mM PPA, por këto ndryshime ishin afërsisht proporcionale, duke sugjeruar që kinetika e ndarjes dhe bashkimit arrijnë ekuilibrin në përqendrime më të larta (Fig. 2b). Vëllimi mesatar mitokondrial mbeti i pandryshuar si në 3 ashtu edhe në 5 mM PPA, duke treguar se integriteti i rrjetit mitokondrial u ruajt (Fig. 2d). Kjo pasqyron aftësinë e rrjeteve dinamike mitokondriale për t'iu përgjigjur stresit të lehtë metabolik për të ruajtur në mënyrë efektive homeostazën pa shkaktuar fragmentim të rrjetit. Në 3 mM PPA, rritja e ndarjes është e mjaftueshme për të nxitur kalimin në një ekuilibër të ri, por kërkohet një rimodelim kinetik më i thellë në përgjigje të stresit të shkaktuar nga përqendrime më të larta të PPA-së.
Numri i mitokondrive u rrit në të dy përqendrimet e stresit të PPA-së, por vëllimi mesatar mitokondrial nuk ndryshoi ndjeshëm (Fig. 2c). Kjo mund të jetë për shkak të rritjes së biogjenezës ose rritjes së ndarjes; megjithatë, në mungesë të një rënieje të konsiderueshme të vëllimit mesatar mitokondrial, ka më shumë të ngjarë që biosinteza të rritet. Megjithatë, të dhënat në Figurën 2 mbështesin ekzistencën e dy mekanizmave kompensues: një rritje në numrin e ngjarjeve të ndarjes, në përputhje me rritjen e ndarjes mitokondriale, dhe një rritje në numrin e ngjarjeve, në përputhje me biogjenezën mitokondriale. Në fund të fundit, kompensimi dinamik për stresin e lehtë mund të përbëhet nga procese të njëkohshme që përfshijnë ndarjen, bashkimin, biogjenezën dhe mitofagjinë. Megjithëse autorët e mëparshëm kanë treguar se PPA rrit mitozën30,39 dhe mitofagjinë29, ne ofrojmë prova për rimodelimin e dinamikës së ndarjes mitokondriale dhe bashkimit në përgjigje të PPA-së. Këto të dhëna konfirmojnë ndryshimet morfologjike të vëzhguara nga TEM dhe ofrojnë një pasqyrë të mëtejshme të mekanizmave të shoqëruar me mosfunksionimin mitokondrial të shkaktuar nga PPA.
Meqenëse as analiza TEM dhe as ajo MEL nuk ofruan prova të drejtpërdrejta të mekanizmave rregullues të gjeneve që qëndrojnë në themel të ndryshimeve morfologjike të vëzhguara, ne shqyrtuam shprehjen e ARN-së të gjeneve të përfshira në metabolizmin mitokondrial, biogjenezën dhe dinamikën. Proto-onkogjeni cMYC është një faktor transkriptimi i përfshirë në rregullimin e mitokondrive, glikolizës, metabolizmit të aminoacideve dhe acideve yndyrore40. Përveç kësaj, dihet që cMYC rregullon shprehjen e gati 600 gjeneve mitokondriale të përfshira në transkriptimin, përkthimin dhe montimin kompleks mitokondrial, duke përfshirë NRF1 dhe TFAM41. NRF1 dhe TFAM janë dy rregullatorë qendrorë të mitozës, që veprojnë pas PGC-1α për të aktivizuar replikimin e mtADN-së. Kjo rrugë aktivizohet nga sinjalizimi cAMP dhe AMPK dhe është e ndjeshme ndaj shpenzimit të energjisë dhe stresit metabolik. Ne gjithashtu shqyrtuam NFE2L2, një rregullator redoks të biogjenezës mitokondriale, për të përcaktuar nëse efektet e PPA mund të ndërmjetësohen nga stresi oksidativ.
Edhe pse shprehja e NFE2L2 mbeti e pandryshuar, ne gjetëm një ulje të vazhdueshme të varur nga doza në shprehjen e cMYC, NRF1 dhe TFAM pas 24 orësh trajtimi me 3 mM dhe 5 mM PPA (Fig. 3a-c). Ulja e shprehjes së cMYC është raportuar më parë si një përgjigje ndaj stresit mitokondrial42, dhe anasjelltas, ulja e shprehjes së cMYC mund të shkaktojë mosfunksionim mitokondrial duke rimodeluar metabolizmin mitokondrial, lidhjen e rrjetit dhe polarizimin e membranës43. Është interesante se cMYC është gjithashtu i përfshirë në rregullimin e ndarjes dhe bashkimit mitokondrial42,43 dhe dihet se rrit fosforilimin DRP1 dhe lokalizimin mitokondrial gjatë ndarjes qelizore44, si dhe ndërmjetëson rimodelimin morfologjik mitokondrial në qelizat staminale neuronale45. Në të vërtetë, fibroblastet me mungesë të cMYC shfaqin madhësi të reduktuar mitokondriale, në përputhje me ndryshimet e shkaktuara nga stresi i PPA43. Këto të dhëna ilustrojnë një marrëdhënie interesante, por ende të paqartë midis cMYC dhe dinamikës mitokondriale, duke ofruar një objektiv interesant për studime të ardhshme të rimodelimin e shkaktuar nga stresi i PPA.
Reduktimi i NRF1 dhe TFAM është në përputhje me rolin e cMYC si një aktivizues i rëndësishëm transkriptues. Këto të dhëna janë gjithashtu në përputhje me studimet e mëparshme në qelizat e kancerit të zorrës së trashë njerëzore që tregojnë se PPA uli shprehjen e mRNA-së së NRF1 në 22 orë, gjë që shoqërohej me pakësimin e ATP-së dhe rritjen e ROS46. Këta autorë gjithashtu raportuan se shprehja e TFAM u rrit në 8.5 orë, por u kthye në nivelet bazë në 22 orë. Në të kundërt, Kim et al. (2019) treguan se shprehja e mRNA-së së TFAM u ul ndjeshëm pas 4 orësh stresi PPA në qelizat SH-SY5Y; megjithatë, pas 72 orësh, shprehja e proteinës TFAM u rrit ndjeshëm dhe numri i kopjeve të mtADN-së u rrit ndjeshëm. Kështu, ulja e numrit të gjeneve të biogjenezës mitokondriale që vëzhguam pas 24 orësh nuk përjashton mundësinë që rritja e numrit të mitokondrive të shoqërohet me aktivizimin e biogjenezës në pikat e mëparshme kohore. Studimet e mëparshme kanë treguar se PPA rrit ndjeshëm ARNi-në dhe proteinën PGC-1α në qelizat SH-SY5Y në 4 orë e 30 minuta, ndërsa acidi propionik rrit biogjenezën mitokondriale në hepatocitet e viçit nëpërmjet PGC-1α në 12 orë e 39 minuta. Është interesante se PGC-1α nuk është vetëm një rregullator i drejtpërdrejtë transkriptues i NRF1 dhe TFAM, por është treguar gjithashtu se rregullon aktivitetin e MFN2 dhe DRP1 duke rregulluar ndarjen dhe bashkimin47. Të marra së bashku, kjo nxjerr në pah lidhjen e ngushtë të mekanizmave që rregullojnë përgjigjet kompensuese mitokondriale të induktuara nga PPA. Për më tepër, të dhënat tona pasqyrojnë çrregullime të rëndësishme të rregullimit transkriptues të biogjenezës dhe metabolizmit nën stresin e PPA-së.
Gjenet STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 dhe DRP1 janë ndër rregullatorët qendrorë të ndarjes, bashkimit dhe dinamikës mitokondriale37,48,49. Ka shumë gjene të tjera të përfshira në dinamikën mitokondriale, megjithatë, STOML2, OPA1 dhe MFN2 janë gjetur më parë të metilohen në mënyrë të ndryshme në grupet ASD,16 dhe disa studime të pavarura kanë raportuar ndryshime në këta faktorë transkriptimi në përgjigje të stresit mitokondrial50,51. 52. Shprehja e të dyve, OPA1 dhe STOML2, u zvogëlua ndjeshëm nga trajtimi me 3 mM dhe 5 mM PPA (Fig. 3e, f). OPA1 është një nga rregullatorët klasikë të bashkimit mitokondrial përmes ndërveprimit të drejtpërdrejtë me MFN1 dhe 2 dhe luan një rol në rimodelimin e kristave dhe morfologjinë mitokondriale53. Roli i saktë i STOML2 në dinamikën mitokondriale mbetet i paqartë, por provat sugjerojnë se ai luan një rol në bashkimin mitokondrial, biogjenezën dhe mitofagjinë.
STOML2 është i përfshirë në ruajtjen e çiftëzimit respirator mitokondrial dhe formimin e komplekseve të zinxhirit respirator54,55 dhe është treguar se ndryshon thellësisht karakteristikat metabolike të qelizave kancerogjene56. Studimet kanë treguar se STOML2 promovon potencialin e membranës mitokondriale dhe biogjenezën përmes ndërveprimit me BAN dhe kardiolipinën 55, 57, 58. Përveç kësaj, studime të pavarura kanë treguar se ndërveprimi midis STOML2 dhe PINK1 rregullon mitofagjinë59,60. Veçanërisht, STOML2 është raportuar të ndërveprojë drejtpërdrejt me dhe të stabilizojë MFN2 dhe gjithashtu luan një rol të rëndësishëm në stabilizimin e izoformave të gjata OPA1 duke penguar proteazën përgjegjëse për degradimin e OPA153,61,62. Ulja e shprehjes së STOML2 e vërejtur në reaksionet PPA mund t'i bëjë këto proteina bashkimi më të ndjeshme ndaj degradimit përmes rrugëve të varura nga ubikuitina dhe proteazomi48. Edhe pse roli i saktë i STOML2 dhe OPA1 në përgjigjen dinamike ndaj PPA është i paqartë, shprehja e zvogëluar e këtyre gjeneve të bashkimit (Figura 3) mund të prishë ekuilibrin midis ndarjes dhe bashkimit dhe të çojë në zvogëlimin e madhësisë mitokondriale (Figura 3). 1).
Nga ana tjetër, shprehja e proteinës OPA1 mbeti e pandryshuar pas 24 orësh, ndërsa nivelet e ARNi-së dhe proteinave të MFN1, MFN2 ose DRP1 nuk ndryshuan ndjeshëm pas trajtimit me PPA (Fig. 3g-i, Fig. 4). Kjo mund të tregojë se nuk ka ndryshime në rregullimin e këtyre faktorëve të përfshirë në bashkimin dhe ndarjen mitokondriale. Megjithatë, vlen të përmendet se secili prej këtyre katër gjeneve rregullohet gjithashtu nga modifikimet post-transkriptuese (PTM) që kontrollojnë aktivitetin e proteinave. OPA1 ka tetë variante alternative të bashkimit që ndahen proteolitikisht në mitokondri për të prodhuar dy izoforma të dallueshme 63. Ekuilibri midis izoformave të gjata dhe të shkurtra përcakton në fund të fundit rolin e OPA1 në bashkimin mitokondrial dhe mirëmbajtjen e rrjetit mitokondrial 64. Aktiviteti i DRP1 rregullohet nga fosforilimi i kinazës II të proteinave të varura nga kalciumi/kalmodulina (CaMKII), ndërsa degradimi i DRP1 rregullohet nga ubikuitinimi dhe SUMOilimi 65. Së fundmi, si DRP1 ashtu edhe MFN1/2 janë GTPaza, kështu që aktiviteti mund të ndikohet nga shkalla e prodhimit të GTP në mitokondri 66. Prandaj, megjithëse shprehja e këtyre proteinave mbetet konstante, kjo mund të mos pasqyrojë aktivitetin ose lokalizimin e pandryshuar të proteinave 67,68. Në të vërtetë, repertorët ekzistues të proteinave PTM shpesh shërbejnë si linja e parë e mbrojtjes përgjegjëse për ndërmjetësimin e përgjigjeve akute ndaj stresit. Në prani të stresit metabolik të moderuar në modelin tonë, ka të ngjarë që PTM të promovojë aktivitetin e rritur të proteinave të bashkimit dhe ndarjes për të rivendosur në mënyrë të mjaftueshme integritetin mitokondrial pa kërkuar aktivizim shtesë të këtyre gjeneve në nivelin e ARNm-së ose proteinave.
Të marra së bashku, të dhënat e mësipërme nxjerrin në pah rregullimin kompleks dhe të varur nga koha të morfologjisë mitokondriale dhe sfidat e sqarimit të këtyre mekanizmave. Për të studiuar shprehjen e gjeneve, së pari është e nevojshme të identifikohen gjenet specifike të synuara në rrugë. Megjithatë, të dhënat tona tregojnë se gjenet në të njëjtën rrugë nuk i përgjigjen në të njëjtën mënyrë të njëjtit stres. Në fakt, studimet e mëparshme kanë treguar se gjenet e ndryshme në të njëjtën rrugë mund të shfaqin profile të ndryshme të përgjigjes kohore30,46. Përveç kësaj, ekzistojnë mekanizma kompleksë pas transkriptimit që prishin marrëdhënien midis transkriptimit dhe funksionit të gjeneve. Studimet proteomike mund të japin një pasqyrë të ndikimit të PTM-ve dhe funksionit të proteinave, por ato gjithashtu paraqesin sfida duke përfshirë metodat me rendiment të ulët, raportet e larta sinjal-zhurmë dhe rezolucionin e dobët.
Në këtë kontekst, studimi i morfologjisë mitokondriale duke përdorur TEM dhe MEL ka potencial të madh për të adresuar pyetje themelore në lidhje me marrëdhënien midis dinamikës dhe funksionit mitokondrial dhe se si kjo ndikon në sëmundje. Më e rëndësishmja, TEM ofron një metodë të drejtpërdrejtë për matjen e morfologjisë mitokondriale si një pikë fundore konvergjente e mosfunksionimit dhe dinamikës mitokondriale51. MEL gjithashtu ofron një metodë të drejtpërdrejtë për vizualizimin e ngjarjeve të ndarjes dhe bashkimit në një mjedis qelizor tre-dimensional, duke lejuar përcaktimin sasior të rimodelimit dinamik mitokondrial edhe në mungesë të ndryshimeve në shprehjen e gjeneve33. Këtu ne nxjerrim në pah dobinë e teknikave të imazherisë mitokondriale në sëmundjet sekondare mitokondriale. Këto sëmundje karakterizohen zakonisht nga stresi kronik i lehtë metabolik i karakterizuar nga rimodelim delikat i rrjeteve mitokondriale në vend të dëmtimit akut mitokondrial. Megjithatë, kompensimi mitokondrial i kërkuar për të ruajtur mitozën nën stres kronik ka pasoja të thella funksionale. Në kontekstin e neuroshkencës, një kuptim më i mirë i këtyre mekanizmave kompensues mund të ofrojë informacion të rëndësishëm në lidhje me neuropatologjinë pleiotropike të shoqëruar me mosfunksionimin mitokondrial.
Në fund të fundit, të dhënat tona nxjerrin në pah dobinë e teknikave të imazherisë për të kuptuar pasojat funksionale të ndërveprimeve komplekse midis shprehjes së gjeneve, modifikimeve të proteinave dhe aktivitetit të proteinave që kontrollojnë dinamikën mitokondriale neuronale. Ne përdorëm PPA për të modeluar mosfunksionimin mitokondrial në një model qelizor neuronal për të fituar njohuri mbi komponentin mitokondrial të Çrregullimit të Spektrit Autik (ÇSA). Qelizat SH-SY5Y të trajtuara me PPA treguan ndryshime në morfologjinë mitokondriale: mitokondritë u bënë të vogla dhe të rrumbullakëta, dhe kristat ishin të përcaktuara dobët kur u vëzhguan nga TEM. Analiza MEL tregon se këto ndryshime ndodhin njëkohësisht me një rritje në ngjarjet e ndarjes dhe bashkimit për të ruajtur rrjetin mitokondrial në përgjigje të stresit të lehtë metabolik. Për më tepër, PPA prish ndjeshëm rregullimin transkriptues të metabolizmit mitokondrial dhe homeostazës. Ne identifikuam cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 dhe OPA1 si rregullatorë kryesorë mitokondrialë të ndërprerë nga stresi i PPA dhe mund të luajnë një rol në ndërmjetësimin e ndryshimeve të shkaktuara nga PPA në morfologjinë dhe funksionin mitokondrial. Studime të ardhshme janë të nevojshme për të karakterizuar më mirë ndryshimet kohore të shkaktuara nga PPA në shprehjen e gjeneve dhe aktivitetin e proteinave, lokalizimin dhe modifikimet post-përkthyese. Të dhënat tona nxjerrin në pah kompleksitetin dhe ndërvarësinë e mekanizmave rregullatorë që ndërmjetësojnë përgjigjen ndaj stresit mitokondrial dhe demonstrojnë dobinë e TEM dhe teknikave të tjera të imazherisë për studime mekanike më të synuara.
Linja qelizore SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) u ble nga Sigma-Aldrich. Qelizat SH-SY5Y u rritën në përzierjen e mediumit Eagle të modifikuar të Dulbecco-s/lëndës ushqyese F-12 (DMEM/F-12) dhe L-glutaminës (SC09411, ScienCell) në shishe 25 cm2 të plotësuara me 20% serum fetal të gjedhit (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) dhe 1% penicilinë-streptomicinë (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) në 37 °C, 5% CO2. Qelizat u subkulturuan deri në 80% bashkim duke përdorur 0.05% tripsinë-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), u centrifuguan në 300 g dhe u vendosën në një dendësi prej afërsisht 7 × 105 qeliza/ml. Të gjitha eksperimentet u kryen në qelizat e padiferencuara SH-SY5Y midis pasazheve 19-22. PPA administrohet si NaP. Tretni pluhurin NaP (CAS Nr. 137-40-6, formula kimike C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) në ujë të ngrohtë MilliQ në një përqendrim prej 1 M dhe ruajeni në 4 °C. Në ditën e trajtimit, holloni këtë tretësirë ​​me 1 M PPA në 3 mM dhe 5 mM PPA në mjedis pa serum (DMEM/F-12 me L-glutaminë). Përqendrimet e trajtimit për të gjitha eksperimentet ishin pa PPA (0 mM, kontroll), 3 mM dhe 5 mM PPA. Eksperimentet u kryen në të paktën tre përsëritje biologjike.
Qelizat SH-SY5Y u mbjellën në balona 25 cm5 me një shpejtësi prej 5.5 × 105 qeliza/ml dhe u rritën për 24 orë. Trajtimi me PPA u shtua në balonë para inkubacionit 24 orësh. Mblidhni peletat e qelizave duke ndjekur protokollet normale të subkulturës së indeve të gjitarëve (të përshkruara më sipër). Risuspensiononi peletin e qelizave në 100 µl 2.5% glutaraldehid, 1 × PBS dhe ruajeni në 4 °C deri në përpunim. Qelizat SH-SY5Y u centrifuguan shkurtimisht për të peletuar qelizat dhe për të hequr tretësirën 2.5% glutaraldehid, 1 × PBS. Risuspensiononi sedimentin në një xhel agaroze 4% të përgatitur në ujë të distiluar (raporti i agarozës ndaj vëllimit të sedimentit është 1:1). Copat e agarozës u vendosën në rrjeta në pllaka të sheshta dhe u veshën me 1-heksadecen para ngrirjes me presion të lartë. Mostrat u ngrinë në aceton 100% të thatë në -90 °C për 24 orë. Temperatura u rrit më pas në -80°C dhe u shtua një tretësirë ​​prej 1% tetoksidi osmiumi dhe 0.1% glutaraldehide. Mostrat u ruajtën në -80°C për 24 orë. Pas kësaj, temperatura u rrit gradualisht në temperaturën e dhomës gjatë disa ditëve: nga – 80 °C në – 50 °C për 24 orë, në – 30 °C për 24 orë, në – 10 °C për 24 orë dhe së fundmi në temperaturën e dhomës.
Pas përgatitjes kriogjenike, mostrat u impregnuan me rrëshirë dhe u bënë prerje ultra të holla (∼100 nm) duke përdorur një ultramikrotom Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Prerjet u ngjyrosën me 2% acetat uranili dhe citrat plumbi. Mostrat u vëzhguan duke përdorur një mikroskop elektronik transmetues FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (më parë FEI), Eindhoven, Holandë) që vepronte në 200 kV (transmetues Lab6) dhe një kamerë Gatan CCD (Gatan, Britani e Madhe) të pajisur me një filtër energjie Tridiem.
Në çdo replikim teknik, u morën të paktën 24 imazhe të qelizave të vetme, për një total prej 266 imazhesh. Të gjitha imazhet u analizuan duke përdorur makron e Rajonit të Interesit (ROI) dhe makron e Mitokondrisë. Makro mitokondriale bazohet në metodat e publikuara17,31,32 dhe lejon përpunimin gjysmë-automatik të imazheve TEM në Fiji/ImageJ69. Me pak fjalë: imazhi përmbyset dhe përmbyset duke përdorur zbritjen e sfondit të topit rrotullues (rrezja 60 piksel) dhe një filtër kalimi brezash FFT (duke përdorur përkatësisht kufij të sipërm dhe të poshtëm prej 60 dhe 8 pikselësh) dhe shtypjen e vijës vertikale me një tolerancë orientimi prej 5%. Imazhi i përpunuar pragohet automatikisht duke përdorur një algoritëm të entropisë maksimale dhe gjenerohet një maskë binare. Rajonet e imazhit të shoqëruara me ROI të zgjedhura manualisht në imazhet TEM të papërpunuara u nxorën, duke karakterizuar mitokondritë dhe duke përjashtuar membranën plazmatike dhe rajone të tjera me kontrast të lartë. Për çdo ROI të nxjerrë, u analizuan grimca binare më të mëdha se 600 piksel, dhe sipërfaqja e grimcave, perimetri, boshtet kryesore dhe të vogla, diametri i Feret, rrumbullakësia dhe rrethësia u matën duke përdorur funksionet e integruara të matjes së Fiji/ImageJ. Sipas Merrill, Flippo dhe Strack (2017), sipërfaqja 2, raporti i aspektit të grimcave (raporti i boshtit kryesor me atë të vogël) dhe faktori i formës (FF) u llogaritën nga këto të dhëna, ku FF = perimetri 2/4pi x zona. Përkufizimi i formulës parametrike mund të gjendet te Merrill, Flippo dhe Strack (2017). Makrot e përmendura janë të disponueshme në GitHub (shih Deklaratën e Disponueshmërisë së të Dhënave). Mesatarisht, u analizuan afërsisht 5,600 grimca për trajtim PPA, për një total prej afërsisht 17,000 grimcash (të dhënat nuk tregohen).
Qelizat SH-SH5Y u vendosën në enë kulture me 8 dhoma (ThermoFisher, #155411) për të lejuar ngjitjen gjatë natës dhe më pas u inkubuan me TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) dhe Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). ngjyrosje. Imazhet u morën duke përdorur lazerë 405 nm dhe 561 nm gjatë një mjedisi 10-minutësh, dhe imazhet e papërpunuara u morën si Z-stacks që përmbanin 10 mikrofote imazhesh me hap az prej 0.2 μm midis kornizave të imazhit në 12 pika kohore pasuese. Imazhet u mblodhën duke përdorur një platformë me superrezolucion Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Gjermani) duke përdorur një lente LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. Imazhet u analizuan në ImageJ duke përdorur një tubacion të përshkruar më parë dhe shtojcën ImageJ për të matur ngjarjet e bashkimit dhe ndarjes, numrin mesatar të strukturave mitokondriale dhe vëllimin mesatar mitokondrial për qelizë33. Makrot MEL janë të disponueshme në GitHub (shih Deklaratën e Disponueshmërisë së të Dhënave).
Qelizat SH-SY5Y u rritën në pllaka me gjashtë puseta me një dendësi prej 0.3 × 106 qeliza/mL për 24 orë para trajtimit. ARN-ja u nxor duke përdorur protokollin Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) me modifikime të vogla: shtoni 300 μl tampon lize ARN në secilën pus para heqjes dhe lizoni secilën mostër si hap përfundimtar me 30 μl ujë pa elucion DNase/RNase. Të gjitha mostrat u kontrolluan për sasi dhe cilësi duke përdorur një Spektrofotometër NanoDrop ND-1000 UV-Vis. Proteina totale nga lizatet qelizore u mor duke përdorur 200 μl tampon lize RIPA, dhe përqendrimi i proteinave u përcaktua duke përdorur analizën e proteinave Bradford70.
Sinteza e ADNc-së u krye duke përdorur Kitin e Sintezës së ADNc-së Tetro™ (BIO-65043, Meridian Bioscience) sipas udhëzimeve të prodhuesit me disa modifikime. ADNc-ja u sintetizua në reaksione 20 μl duke përdorur 0.7 deri në 1 μg ARN totale. Prajmerët u zgjodhën nga punimet e botuara më parë 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Tabela S1) dhe sondat shoqëruese u projektuan duke përdorur mjetin PrimerQuest nga Integrated DNA Technologies. Të gjitha gjenet me interes u normalizuan në gjenin bërthamor B2M. Shprehja e gjenit të STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC dhe OPA1 u mat me RT-qPCR. Përzierja kryesore përfshinte polimerazën LUNA Taq (M3003L, New England Biolabs), prajmerë të përparmë dhe të kundërt 10 μM, ADNc dhe ujë të gradës PCR për të dhënë një vëllim përfundimtar prej 10 μL për secilin reaksion. Shprehja e gjeneve të ndarjes dhe ndarjes (DRP1, MFN1/2) u mat duke përdorur analizat multiplekse TaqMan. Përzierja kryesore Luna Universal Probe qPCR (M3004S, New England Biolabs) u përdor sipas udhëzimeve të prodhuesit me modifikime të vogla. Përzierja kryesore multiplekse RT-qPCR përfshin 1X LUNA Taq polimerazë, prajmerë të përparmë dhe të kundërt 10 μM, sondë 10 μM, ADNc dhe ujë të gradës PCR, duke rezultuar në një vëllim përfundimtar prej 20 μL për secilin reaksion. RT-qPCR u krye duke përdorur Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG - numri serial: R0618110). Kushtet e ciklit tregohen në Tabelën S1. Të gjitha mostrat e ADNc-së u amplifikuan në trefish dhe u gjenerua një kurbë standarde duke përdorur një seri hollimesh dhjetëfish. Vlerat ekstreme në mostrat trefishe me devijim standard të pragut të ciklit (Ct) >0.5 u hoqën nga analiza për të siguruar riprodhueshmërinë e të dhënave30,72. Shprehja relative e gjenit u llogarit duke përdorur metodën 2-ΔΔCt79.
Mostrat e proteinave (60 μg) u përzien me tamponin e ngarkimit Laemmli në një raport 2:1 dhe u përdorën në një xhel proteine ​​pa ngjyrë 12% (Bio-Rad #1610184). Proteinat u transferuan në një membranë PVDF (fluorur poliviniliden) (#170-84156, Bio-Rad) duke përdorur sistemin Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). Membrana u bllokua dhe u inkubua me antitrupat primarë të përshtatshëm (OPA1, MFN1, MFN2 dhe DRP1) (të holluar 1:1000) për 48 orë, e ndjekur nga inkubimi me antitrupa sekondarë (1:10,000) për 1 orë. Membranat më pas u imazhuan duke përdorur Substratin Clarity Western ECL (#170-5061, Bio-Rad) dhe u regjistruan duke përdorur një sistem Bio-Rad ChemiDoc MP. Versioni 6.1 i ImageLab u përdor për analizën Western blot. Xheli dhe bloti origjinal janë paraqitur në Figurën S1. Informacioni mbi antitrupat është dhënë në Tabelën S2.
Setet e të dhënave paraqiten si mesatarja dhe gabimi standard i mesatares (SEM) të të paktën tre mostrave të pavarura. Setet e të dhënave u testuan për normalitet duke përdorur testin Shapiro-Wilks (përveç nëse përcaktohet ndryshe) përpara se të supozohej një shpërndarje Gaussiane dhe devijime standarde të barabarta dhe të vazhdohej me analizat. Përveç analizimit të setit të të dhënave duke përdorur MEL LSD të Fisher (p < 0.05), ANOVA me një drejtim (mesatarja e trajtimit kundrejt kontrollit) dhe testin e krahasimit të shumëfishtë të Dunnett për të përcaktuar rëndësinë (p < 0.05). Vlerat e rëndësishme të p tregohen në grafik si *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Të gjitha analizat statistikore dhe grafikët u kryen dhe u gjeneruan duke përdorur GraphPad Prism 9.4.0.
Makrot Fiji/ImageJ për analizën e imazheve TEM janë të disponueshme publikisht në GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Makroja Mitochondrial Event Locator (MEL) është e disponueshme publikisht në GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM dhe Vijaya A. Mitokondria: rregullatorët kryesorë të metabolizmit, homeostazës, stresit, plakjes dhe epigjenetikës. Indonezisht. Shkenca Biomjekësore. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Mosfunksionimi shumëplanësh mitokondrial në skizofreni, kompleksi I si një objektiv i mundshëm patologjik. Skizofrenia. burim. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. dhe Beal, MF Mosfunksionimi mitokondrial në sëmundjen e Parkinsonit. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG dhe Mehta V. Mitokondritë e stresuara: objektiva të pushtimit në sëmundjen e Alzheimerit. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF dhe Ferreira GK Mitokondria dhe truri: bioenergjetika dhe më shumë. Neurotoksinat. burim. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Mitokondritë pleiotropike: ndikimi i mitokondrive në zhvillimin neuronal dhe sëmundjet. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. dhe Morais, VA Biogjeneza mitokondriale në neurone: si dhe ku. ndërkombëtarizimi. J. Mohr. shkenca. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. dhe Zhao, J. Rregullimi i dinamikës mitokondriale të gjitarëve: mundësi dhe sfida. front. endokrin. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. dhe Slack, RS Dinamika mitokondriale në rregullimin e neurogjenezës: nga truri në zhvillim deri te truri i rritur. zhvillim. dinamik. 247, 47–53 (2018).