Aktual *Adresa aktuale: Këln 50931, Gjermani, Kërkime në Këln mbi Përgjigjen Qelizore ndaj Stresit në Sëmundjet e Lidhura me Plakjen (CECAD).
Neurodegjenerimi i sëmundjeve mitokondriale konsiderohet i pakthyeshëm sepse plasticiteti metabolik i neuroneve është i kufizuar, por efekti i mosfunksionimit mitokondrial në autonominë qelizore të metabolizmit neuronal në trup nuk është kuptuar mirë. Këtu, ne prezantojmë proteomën specifike qelizore të neuroneve Purkinje me mungesë progresive të OXPHOS të shkaktuar nga dinamika e ndërprerë e bashkimit mitokondrial. Ne zbuluam se mosfunksionimi mitokondrial shkaktoi një ndryshim të thellë në fushën e proteomikës, i cili në fund të fundit çoi në aktivizimin sekuencial të programeve të sakta metabolike para vdekjes së qelizave. Papritur, ne përcaktuam induksionin e dukshëm të piruvat karboksilazës (PCx) dhe enzimave të tjera kundër plakjes që plotësojnë ndërmjetësit e ciklit TCA. Frenimi i PCx përkeqësoi stresin oksidativ dhe neurodegjenerimin, duke treguar se ateroskleroza ka një efekt mbrojtës në neuronet që nuk kanë OXPHOS. Rivendosja e bashkimit mitokondrial në neuronet e degjeneruara terminalisht përmbys plotësisht këto karakteristika metabolike, duke parandaluar kështu vdekjen e qelizave. Gjetjet tona identifikojnë shtigje të panjohura më parë që i japin rezistencë mosfunksionimit mitokondrial dhe tregojnë se neurodegjenerimi mund të përmbyset edhe në fazat e vona të sëmundjes.
Roli qendror i mitokondrive në ruajtjen e metabolizmit të energjisë neuronale theksohet nga simptomat e gjera neurologjike të shoqëruara me sëmundjet mitokondriale njerëzore. Shumica e këtyre sëmundjeve shkaktohen nga mutacionet e gjeneve që rregullojnë shprehjen e gjeneve mitokondriale (1, 2) ose shkatërrimin e gjeneve që lidhen me dinamikën mitokondriale, të cilat ndikojnë indirekt në stabilitetin e ADN-së mitokondriale (mtDNA) (3, 4). Puna në modelet shtazore ka treguar se në përgjigje të mosfunksionimit mitokondrial në indet përreth, mund të aktivizohen shtigje metabolike konservative (5-7), gjë që ofron informacion të rëndësishëm për një kuptim të thellë të patogjenezës së këtyre sëmundjeve komplekse. Në kontrast të plotë, kuptimi ynë i ndryshimeve metabolike të llojeve specifike të qelizave të shkaktuara nga dështimi i përgjithshëm i prodhimit të adenozin trifosfatit mitokondrial të trurit (ATP) është themelor (8), duke theksuar nevojën për të identifikuar objektivat terapeutikë që mund të përdoren për të parandaluar ose parandaluar sëmundjet. Parandaloni neurodegjenerimin (9). Mungesa e informacionit është fakti se qelizat nervore konsiderohen gjerësisht se kanë fleksibilitet shumë të kufizuar metabolik krahasuar me llojet e qelizave të indeve përreth (10). Duke pasur parasysh që këto qeliza luajnë një rol qendror në koordinimin e furnizimit të neuroneve me metabolitë për të nxitur transmetimin sinaptik dhe për t'iu përgjigjur kushteve të lëndimit dhe sëmundjes, aftësia për të përshtatur metabolizmin qelizor me kushtet sfiduese të indeve të trurit është pothuajse e kufizuar në qelizat gliale (11-14). Përveç kësaj, heterogjeniteti qelizor i natyrshëm i indeve të trurit pengon kryesisht studimin e ndryshimeve metabolike që ndodhin në nëngrupe specifike neuronale. Si rezultat, dihet pak rreth pasojave të sakta qelizore dhe metabolike të mosfunksionimit mitokondrial në neurone.
Për të kuptuar pasojat metabolike të mosfunksionimit mitokondrial, ne izoluam neuronet Purkinje (NP) në faza të ndryshme të neurodegjenerimit të shkaktuar nga shkatërrimi i bashkimit të membranës së jashtme mitokondriale (Mfn2). Edhe pse mutacionet e Mfn2 tek njerëzit shoqërohen me një formë të neuropatisë motorike shqisore trashëgimore të njohur si Charcot-Marie-Tooth tipi 2A (15), shkatërrimi i kushtëzuar i Mfn2 tek minjtë është një metodë e njohur mirë e induksionit të oksidimit të fosforilimit (OXPHOS). Nëntipet e ndryshme neuronale (16-19) dhe fenotipi neurodegjenerativ që rezulton shoqërohen me simptoma neurologjike progresive, të tilla si çrregullime të lëvizjes (18, 19) ose ataksi cerebellare (16). Duke përdorur një kombinim të proteomikës sasiore pa etiketë (LFQ), metabolomikës, imazherisë dhe metodave virologjike, ne tregojmë se neurodegjenerimi progresiv nxit fuqishëm piruvat karboksilazën (PCx) dhe faktorë të tjerë të përfshirë në arteriosklerozën e NP-ve in vivo. Shprehja e enzimave. Për të verifikuar rëndësinë e këtij zbulimi, ne e ulëm në mënyrë specifike shprehjen e PCx në PN me mungesë të Mfn2 dhe zbuluam se ky operacion përkeqësoi stresin oksidativ dhe përshpejtoi neurodegjenerimin, duke vërtetuar kështu se azoospermia jep vdekjen e qelizave, përshtatshmërinë metabolike. Shprehja e rëndë e MFN2 mund ta shpëtojë plotësisht PN me degjenerim terminal me mungesë të rëndë të OXPHOS, konsum masiv të ADN-së mitokondriale dhe rrjet mitokondrial me sa duket të prishur, gjë që thekson më tej se kjo formë e neurodegjenerimit mund të rikuperohet edhe në fazën e avancuar të sëmundjes para vdekjes së qelizave.
Për të vizualizuar mitokondritë në PN-të e eliminuara nga Mfn2, ne përdorëm një lloj miu që lejon mitokondritë e varura nga Cre të synojnë shprehjen Cre të proteinës fluoreshente të verdhë (YFP) (mtYFP) (20) dhe kontrolluam morfologjinë mitokondriale in vivo. Ne zbuluam se shkatërrimi i gjenit Mfn2 në PN do të çonte në ndarjen graduale të rrjetit mitokondrial (Figura S1A), dhe ndryshimi më i hershëm u gjet në moshën 3 javë. Në të kundërt, degjenerimi i konsiderueshëm i shtresës qelizore PN, siç dëshmohet nga humbja e imunongjyrosjes së Calbindin, nuk filloi deri në moshën 12 javë (Figura 1, A dhe B). Mospërputhja kohore midis ndryshimeve më të hershme në morfologjinë mitokondriale dhe fillimit të dukshëm të vdekjes neuronale na shtyu të hetojmë ndryshimet metabolike të shkaktuara nga mosfunksionimi mitokondrial para vdekjes qelizore. Ne zhvilluam një strategji të bazuar në renditjen e qelizave të aktivizuara me fluoreshencë (FACS) për të izoluar PN që shprehin YFP (YFP+) (Figura 1C), dhe në minjtë e kontrollit (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), të referuara më poshtë si CTRL (Figura S1B). Optimizimi i strategjisë së hapjes bazuar në intensitetin relativ të sinjalit YFP na lejon të pastrojmë trupin YFP+ (YFPhigh) të PN-ve nga jo-PN-të (YFPneg) (Figura S1B) ose fragmente të supozuara fluoreshente të aksonit/dendritikës (YFPlow; Figura S1D, majtas), të konfirmuara nga mikroskopi konfokal (Figura S1D, djathtas). Për të verifikuar identitetin e popullatës së klasifikuar, ne kryem proteomikën LFQ dhe më pas analizën e komponentëve kryesorë, dhe zbuluam se ekziston një ndarje e qartë midis qelizave YFPhigh dhe YFPneg (Figura S1C). Qelizat YFPhigh treguan një pasurim neto të shënuesve të njohur të PN-ve (p.sh. Calb1, Pcp2, Grid2 dhe Itpr3) (21, 22), por asnjë pasurim të proteinave të shprehura zakonisht në neurone ose lloje të tjera qelizash (Figura 1D). Një krahasim midis mostrave në qelizat e klasifikuara YFPhigh të mbledhura në eksperimente të pavarura tregoi një koeficient korrelacioni > 0.9, duke demonstruar riprodhueshmëri të mirë midis replikimeve biologjike (Figura S1E). Në përmbledhje, këto të dhëna vërtetuan planin tonë për izolim akut dhe specifik të PN-së së realizueshme. Meqenëse sistemi nxitës L7-cre i përdorur shkakton rekombinim mozaik në javën e parë pas lindjes (23), ne filluam të skartojmë minjtë nga neuronet e koleksionit CTRL dhe të kushtëzuar (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre). Pasi të përfundojë rekombinimi, quhet Mfn2cKO në moshën 4 javë. Si pikë përfundimtare, ne zgjodhëm moshën 8 javëshe kur shtresa PN ishte e paprekur pavarësisht fragmentimit të dukshëm mitokondrial (Figura 1B dhe Figura S1A). Në total, ne përcaktuam sasinë e një totali prej 3013 proteinash, nga të cilat rreth 22% u bazuan në shënimet MitoCarta 2.0 bazuar në proteomën mitokondriale si mitokondri (Figura 1E) (Figura 1E) (24). Analiza e shprehjes diferenciale të gjenit e kryer në javën 8 tregoi se vetëm 10.5% e të gjitha proteinave kishin ndryshime të rëndësishme (Figura 1F dhe Figura S1F), nga të cilat 195 proteina ishin të rregulluara poshtë dhe 120 proteina ishin të rregulluara lart (Figura 1F). Vlen të përmendet se "analiza e rrugës inovative" e këtij grupi të dhënash tregon se gjenet e shprehura në mënyrë të ndryshme i përkasin kryesisht një grupi të kufizuar të rrugëve specifike metabolike (Figura 1G). Është interesante se, megjithëse ulja e rregullimit të rrugëve që lidhen me OXPHOS dhe sinjalizimin e kalciumit konfirmon induksionin e mosfunksionimit mitokondrial në PN-të me mungesë të bashkimit, kategoritë e tjera që përfshijnë kryesisht metabolizmin e aminoacideve janë të rritura ndjeshëm, gjë që është në përputhje me metabolizmin që ndodh në PN-të mitokondriale. Ri-integrimi është i qëndrueshëm. mosfunksionim.
(A) Fotografi konfokale përfaqësuese të seksioneve cerebelare të minjve CTRL dhe Mfn2cKO që tregojnë humbje progresive të PN-ve (kalbindina, gri); bërthamat u kundërngjyrosën me DAPI. (B) Kuantifikimi i (A) (analizë njëkahëshe e variancës, ***P<0.001; n = 4 deri në 6 rrathë nga tre minj). (C) Fluksi eksperimental i punës. (D) Shpërndarja e hartës së nxehtësisë së shënuesve specifikë për Purkinje (sipër) dhe lloje të tjera qelizash (në mes). (E) Diagrami Venn që tregon numrin e proteinave mitokondriale të identifikuara në PN të klasifikuar. (F) Grafiku i Vullkanit i proteinave të shprehura në mënyrë të ndryshme në neuronet Mfn2cKO në 8 javë (vlera e ndërprerjes së rëndësisë prej 1.3). (G) Analiza e rrugës së kreativitetit tregon pesë rrugët më të rëndësishme të rregullimit lart (e kuqe) dhe poshtë (blu) në PN Mfn2cKO të klasifikuar si 8 javë. Tregohet niveli mesatar i shprehjes së secilës proteinë të zbuluar. Harta e nxehtësisë në shkallë gri: vlera e P e rregulluar. ns, jo e rëndësishme.
Të dhënat e proteomikës treguan se shprehja e proteinave të komplekseve I, III dhe IV u ul gradualisht. Komplekset I, III dhe IV përmbanin të gjitha nën-njësi thelbësore të koduara nga mtADN, ndërsa kompleksi II, i cili ishte i koduar vetëm nga bërthama, ishte praktikisht i paprekur (Figura 2A dhe Figura S2A). Në përputhje me rezultatet e proteomikës, imunohistokimia e seksioneve të indeve cerebelare tregoi se niveli i nën-njësisë MTCO1 (nën-njësia 1 e oksidazës së citokromit C mitokondriale) e kompleksit IV në PN u ul gradualisht (Figura 2B). Nën-njësia Mtatp8 e koduar nga mtADN u ul ndjeshëm (Figura S2A), ndërsa niveli i gjendjes së qëndrueshme të nën-njësisë ATP sintazë të koduar nga bërthama mbeti i pandryshuar, gjë që është në përputhje me kompleksin e njohur të qëndrueshëm të nën-asamblesë F1 të ATP sintazës kur shprehja e mtADN është e qëndrueshme. Formimi është i qëndrueshëm. Ndërprerje (7). Vlerësimi i nivelit të mtADN-së në PN-të e renditura Mfn2cKO me anë të reaksionit zinxhir të polimerazës në kohë reale (qPCR) konfirmoi rënien graduale të numrit të kopjeve të mtADN-së. Krahasuar me grupin e kontrollit, në moshën 8 javë, vetëm rreth 20% e nivelit të mtADN-së u ruajt (Figura 2C). Në përputhje me këto rezultate, ngjyrosja konfokale e mikroskopisë së PN-ve Mfn2cKO u përdor për të zbuluar ADN-në, duke treguar konsumin e varur nga koha të nukleotideve mitokondriale (Figura 2D). Ne zbuluam se vetëm disa kandidatë të përfshirë në degradimin e proteinave mitokondriale dhe përgjigjen ndaj stresit ishin të rregulluar lart, duke përfshirë Lonp1, Afg3l2 dhe Clpx, dhe faktorët e montimit kompleks OXPHOS. Nuk u zbuluan ndryshime të rëndësishme në nivelet e proteinave të përfshira në apoptozë (Figura S2B). Në mënyrë të ngjashme, ne zbuluam se kanalet e mitokondrive dhe të retikulumit endoplazmatik të përfshira në transportin e kalciumit kanë vetëm ndryshime të vogla (Figura S2C). Përveç kësaj, vlerësimi i proteinave të lidhura me autofagjinë nuk gjeti ndryshime të rëndësishme, gjë që është në përputhje me induksionin e dukshëm të autofagosomeve të vëzhguar in vivo nga imunohistokimia dhe mikroskopia elektronike (Figura S3). Megjithatë, mosfunksionimi progresiv i OXPHOS në PN shoqërohet me ndryshime të dukshme mitokondriale ultrastrukturale. Grumbujimet mitokondriale mund të shihen në trupat qelizorë dhe pemët dendritike të PN-ve Mfn2cKO të moshës 5 dhe 8 javë, dhe struktura e membranës së brendshme ka pësuar ndryshime të thella (Figura S4, A dhe B). Në përputhje me këto ndryshime ultrastrukturale dhe një rënie të konsiderueshme të mtADN-së, analiza e fetave akute cerebrale me metil ester tetrametilrodamine (TMRM) tregoi se potenciali i membranës mitokondriale në PN-të Mfn2cKO ishte ulur ndjeshëm (Figura S4C).
(A) Analiza e rrjedhës kohore të nivelit të shprehjes së kompleksit OXPHOS. Merrni në konsideratë vetëm proteinat me P<0.05 në 8 javë (ANOVA me dy drejtime). Vija me pika: Pa rregullim krahasuar me CTRL. (B) Majtas: Një shembull i një seksioni cerebelar të etiketuar me antitrup anti-MTCO1 (shiriti i shkallës, 20 μm). Zona e zënë nga trupat e qelizave Purkinje është e mbuluar me të verdhë. Djathtas: Kuantifikimi i niveleve të MTCO1 (analiza njëkahëshe e variancës; n = 7 deri në 20 qeliza të analizuara nga tre minj). (C) Analiza qPCR e numrit të kopjeve të mtADN-së në PN-në e renditur (analiza njëkahëshe e variancës; n = 3 deri në 7 minj). (D) Majtas: Një shembull i një prerjeje cerebelare të etiketuar me një antitrup anti-ADN (shiriti i shkallës, 20 μm). Zona e zënë nga trupat e qelizave Purkinje është e mbuluar me të verdhë. Djathtas: Kuantifikimi i lezioneve të mtADN-së (analiza njëkahëshe e variancës; n = 5 deri në 9 qeliza nga tre minj). (E) Një shembull i një prerjeje cerebellare akute që tregon qelizat mitoYFP + Purkinje (shigjeta) në një regjistrim të të gjithë qelizave me kapëse patch. (F) Kuantifikimi i kurbës IV. (G) Regjistrime përfaqësuese të injektimit të rrymës depolarizuese në qelizat CTRL dhe Mfn2cKO Purkinje. Gjurmimi i sipërm: Pulsi i parë që shkaktoi AP. Gjurmimi i poshtëm: Frekuenca maksimale e AP. (H) Kuantifikimi i inputeve spontane postsinaptike (sPSP). Gjurmimi përfaqësues i regjistrimit dhe raporti i zmadhimit të tij tregohen në (I). Analiza njëkahëshe e variancës analizoi n = 5 deri në 20 qeliza nga tre minj. Të dhënat shprehen si mesatare ± SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Gjurmët përfaqësuese të AP spontane të regjistruara duke përdorur modalitetin e kapëses së patch të shpuar. Gjurmimi i sipërm: Frekuenca maksimale e AP. Gjurmimi i poshtëm: zmadhimi i një AP të vetëm. (K) Kuantifikoni frekuencën mesatare dhe maksimale të AP sipas (J). Testi Mann-Whitney; n = 5 qeliza u analizuan nga katër minj. Të dhënat shprehen si mesatare ± SEM; nuk është e rëndësishme.
Dëmtimi i dukshëm i OXPHOS u zbulua në PN 8-javësh të Mfn2cKO, duke treguar se funksioni fiziologjik i neuroneve është rëndë anormal. Prandaj, ne analizuam karakteristikat elektrike pasive të neuroneve me mungesë të OXPHOS në 4 deri në 5 javë dhe 7 deri në 8 javë duke kryer regjistrime të clamp-it të qelizave të tëra në prerje akute cerebelare (Figura 2E). Papritur, potenciali mesatar i membranës në qetësi dhe rezistenca hyrëse e neuroneve Mfn2cKO ishin të ngjashme me kontrollin, megjithëse kishte dallime delikate midis qelizave (Tabela 1). Në mënyrë të ngjashme, në moshën 4 deri në 5 javë, nuk u gjetën ndryshime të rëndësishme në marrëdhënien rrymë-tension (kurba IV) (Figura 2F). Megjithatë, asnjë neuron Mfn2cKO 7 deri në 8 javë i mbijetoi regjimit IV (hapi i hiperpolarizimit), duke treguar se ekziston një ndjeshmëri e qartë ndaj potencialit të hiperpolarizimit në këtë fazë të vonë. Në të kundërt, në neuronet Mfn2cKO, rrymat depolarizuese që shkaktojnë shkarkime të potencialit të veprimit përsëritës (AP) tolerohen mirë, duke treguar se modelet e tyre të përgjithshme të shkarkimit nuk janë dukshëm të ndryshme nga ato të neuroneve të kontrollit 8-javor (Tabela 1 dhe Figura 2G). Në mënyrë të ngjashme, frekuenca dhe amplituda e rrymave spontane postsinaptike (sPSC) ishin të krahasueshme me ato të grupit të kontrollit, dhe frekuenca e ngjarjeve u rrit nga 4 javë në 5 javë në 7 javë në 8 javë me një rritje të ngjashme (Figura 2, H dhe I). Periudha e maturimit sinaptik në PN (25). Rezultate të ngjashme u morën pas njollave të shpuara të PN. Ky konfigurim parandalon kompensimin e mundshëm të defekteve qelizore të ATP-së, siç mund të ndodhë në regjistrimin e kapëses së njollave të të gjithë qelizave. Në veçanti, potenciali i membranës në qetësi dhe frekuenca e shkrepjes spontane të neuroneve Mfn2cKO nuk u prekën (Figura 2, J dhe K). Si përmbledhje, këto rezultate tregojnë se neuronet parafinale me mosfunksionim të dukshëm të OXPHOS mund të përballojnë mirë modelet e shkarkimit me frekuencë të lartë, duke treguar se ekziston një mekanizëm kompensimi që u lejon atyre të mbajnë përgjigje elektrofiziologjike pothuajse normale.
Të dhënat shprehen si mesatare ± SEM (analizë njëkahëshe e variancës, testi i krahasimit të shumëfishtë i Holm-Sidak; *P<0.05). Numri i njësisë tregohet me kllapa.
Ne nisëm të hetojmë nëse ndonjë kategori në të dhënat e proteomikës (Figura 1G) përfshin rrugë që mund të kundërveprojnë mungesën e rëndë të OXPHOS, duke shpjeguar kështu pse PN e prekur mund të mbajë elektrofiziologji pothuajse normale (Figura 2, E deri në K). Analiza e proteomikës tregoi se enzimat e përfshira në katabolizmin e aminoacideve me zinxhir të degëzuar (BCAA) ishin të rregulluara ndjeshëm (Figura 3A dhe Figura S5A), dhe produkti përfundimtar acetil-CoA (CoA) ose sukcinil CoA mund të plotësojnë trikarboksilatet në ciklin e acidit të arteriosklerozës (TCA). Ne zbuluam se përmbajtja e BCAA transaminazës 1 (BCAT1) dhe BCAT2 u rrit të dyja. Ato katalizojnë hapin e parë të katabolizmit të BCAA duke gjeneruar glutamat nga α-ketoglutarati (26). Të gjitha nënnjësitë që përbëjnë kompleksin e dehidrogjenazës së acidit keto me zinxhir të degëzuar (BCKD) janë të rregulluara në rritje (kompleksi katalizon dekarboksilimin pasues dhe të pakthyeshëm të skeletit të karbonit BCAA që rezulton) (Figura 3A dhe Figura S5A). Megjithatë, nuk u gjetën ndryshime të dukshme në vetë BCAA në PN të renditura, të cilat mund të jenë për shkak të rritjes së përthithjes qelizore të këtyre aminoacideve esenciale ose përdorimit të burimeve të tjera (glukozë ose acid laktik) për të plotësuar ciklin TCA (Figura S5B). PN-të që nuk kishin OXPHOS gjithashtu treguan aktivitete të rritura të dekompozimit të glutaminës dhe transaminimit në moshën 8 javë, gjë që mund të pasqyrohet nga rregullimi në rritje i enzimave mitokondriale glutaminazë (GLS) dhe glutaminë piruvat transaminazë 2 (GPT2) (Figura 3, A dhe C). Vlen të përmendet se rritja e GLS është e kufizuar në izoformën e splajsuar glutaminazë C (GLS-GAC) (ndryshimi i Mfn2cKO/CTRL është afërsisht 4.5-fish, P = 0.05), dhe rritja e saj specifike në indet kancerogjene mund të mbështesë bioenergjinë mitokondriale. (27).
(A) Harta e nxehtësisë tregon ndryshimin e nivelit të proteinave për rrugën e specifikuar në 8 javë. (B) Shembull i një fete cerebellare të etiketuar me antitrup anti-PCx (shiriti i shkallës, 20 μm). Shigjeta e verdhë tregon trupin e qelizës Purkinje. (C) Analiza e shprehjes së proteinave në rrjedhën kohore e identifikuar si një kandidat i rëndësishëm për aterosklerozën (testi t i shumëfishtë, *FDR <5%; n = 3-5 minj). (D) Sipër: Një diagram skematik që tregon mënyrat e ndryshme të hyrjes së karbonit të etiketuar të përmbajtur në gjurmuesin e piruvatit [1-13C] (domethënë, nëpërmjet PDH ose rrugës trans-arteriale). Poshtë: Grafiku i violinës tregon përqindjen e karbonit të etiketuar me një të vetme (M1) të konvertuar në acid aspartik, acid citrik dhe acid malik pas etiketimit të fetave akute cerebellare me piruvat [1-13C] (testi t i çiftëzuar; ** P <0.01). (E) Analizë gjithëpërfshirëse e historisë kohore të rrugës së treguar. Merrni në konsideratë vetëm proteinat me P<0.05 në 8 javë. Vijë e ndërprerë: pa vlerë rregullimi (analizë dypalëshe e variancës; * P <0.05; *** P <0.001). Të dhënat shprehen si mesatare ± SEM.
Në analizën tonë, katabolizmi i BCAA-së është bërë një nga rrugët kryesore të rritjes. Ky fakt sugjeron fuqimisht se vëllimi i ventilimit që hyn në ciklin TCA mund të ndryshohet në PN që nuk ka OXPHOS. Kjo mund të përfaqësojë një formë kryesore të rilidhjes metabolike neuronale, e cila mund të ketë një ndikim të drejtpërdrejtë në fiziologjinë dhe mbijetesën neuronale gjatë mirëmbajtjes së mosfunksionimit të rëndë të OXPHOS. Në përputhje me këtë hipotezë, zbuluam se enzima kryesore anti-aterosklerotike PCx është e rritur (Mfn2cKO/CTRL ndryshon afërsisht 1.5 herë; Figura 3A), e cila katalizon shndërrimin e piruvatit në oksaloacetat (28), i cili besohet të jetë në indin e trurit. Shprehja në është e kufizuar në astrocite (29, 30). Në përputhje me rezultatet e proteomikës, mikroskopia konfokale tregoi se shprehja e PCx ishte rritur në mënyrë specifike dhe të konsiderueshme në PN me mungesë të OXPHOS, ndërsa reaktiviteti i PCx ishte i kufizuar kryesisht në qelizat gliale Bergmann ngjitur të kontrollit (Figura 3B). Për të testuar në mënyrë funksionale rritjen e vëzhguar të PCx, ne trajtuam feta akute cerebellare me gjurmues [1-13C]piruvat. Kur piruvati u oksidua nga piruvat dehidrogjenaza (PDH), etiketa e tij izotopike u zhduk , por përfshihet në ndërmjetësit e ciklit TCA kur piruvati metabolizohet nga reaksionet vaskulare (Figura 3D). Në mbështetje të të dhënave tona proteomike, ne vëzhguam një numër të madh shënjuesish nga ky gjurmues në acidin aspartik të fetave Mfn2cKO, ndërsa acidi citrik dhe acidi malik gjithashtu kishin një trend të moderuar, megjithëse jo të rëndësishëm (Figura 3D).
Në neuronet e dopaminës së minjve MitoPark me mosfunksionim mitokondrial të shkaktuar nga neuronet e dopaminës që shkatërrojnë posaçërisht gjenin e faktorit të transkriptimit mitokondrial A (Tfam) (Figura S6B), shprehja e PCx ishte gjithashtu e rritur ndjeshëm (31), duke treguar se arterioskleroza e acidit aceton. Shfaqja e sëmundjes rregullohet gjatë mosfunksionimit të OXPHOS neuronal në trup. Vlen të përmendet se është zbuluar se enzimat unike (32-34) që mund të shprehen në neuronet që mund të shoqërohen me arteriosklerozë janë të rritur ndjeshëm në PN që nuk kanë OXPHOS, siç është propionil-CoA karboksilaza (PCC-A), Malonil-CoA e shndërron propionil-CoA në suksinil-CoA dhe enzima malike mitokondriale 3 (ME3), roli kryesor i së cilës është të rikuperojë piruvatin nga malati (Figura 3, A dhe C) (33, 35). Përveç kësaj, gjetëm një rritje të konsiderueshme të enzimës Pdk3, e cila fosforilon dhe kështu inaktivizon PDH (36), ndërsa nuk u zbuluan ndryshime në enzimën Pdp1 që aktivizon PDH ose në vetë kompleksin enzimatik PDH (Figura 3A). Në mënyrë të vazhdueshme, në PN-të Mern2cKO, fosforilimi i nënnjësisë α1 α (PDHE1α) të përbërësit E1 të piruvat dehidrogjenazës së kompleksit PDH në Ser293 (i njohur për frenimin e aktivitetit enzimatik të PDH) u rrit (Figura S6C) (Figura S6C). Piruvati nuk ka akses vaskular.
Së fundmi, zbuluam se super rruga e biosintezës së serinës dhe glicinës, cikli i folatit mitokondrial (1C) që lidhet me të dhe biosinteza e prolinës (Figura 1G dhe Figura S5C) janë të gjitha të rregulluara në mënyrë të konsiderueshme, sipas raporteve, gjatë procesit të aktivizimit. Indet përreth aktivizohen me mosfunksionim mitokondrial (5-7). Analiza konfokale që mbështet këto të dhëna proteomike tregoi se në nefropatinë periferike me mungesë të OXPHOS, fetat cerebellare të minjve 8-javësh iu nënshtruan serinë hidroksimetiltransferazës 2 (SHMT2), një enzimë kyçe e ciklit të folatit mitokondrial. Përgjigje imune e rëndësishme (Figura S5D). Në 13 feta akute cerebellare të inkubuara me CU-glukozë, eksperimentet e gjurmimit metabolik konfirmuan më tej rregullimin në rritje të biosintezës së serinës dhe prolinës, duke treguar se fluksi i izoformave të karbonit në serinë dhe prolinë është rritur (Figura S5E). Meqenëse reaksionet e nxitura nga GLS dhe GPT2 janë përgjegjëse për sintezën e glutamatit nga glutamina dhe transaminimin midis glutamatit dhe α-ketoglutaratit, rritja e tyre tregon se neuronet me mungesë të OXPHOS kanë një kërkesë në rritje për glutamat. Kjo mund të synojë ruajtjen e biosintezës së rritur të prolinës (Figura S5C). Në kontrast me këto ndryshime, një analizë proteomike e astrociteve cerebellare nga minjtë Mfn2cKO specifikë për PN tregoi se këto rrugë (duke përfshirë të gjitha antiperoksidazat) nuk ndryshuan ndjeshëm në shprehje, duke demonstruar kështu se ky ridrejtim metabolik është selektiv ndaj PN të degraduar (Fig. S6, D në G).
Si përmbledhje, këto analiza zbuluan modele dukshëm të ndryshme të aktivizimit kohor të shtigjeve specifike metabolike në PN. Megjithëse funksioni jonormal mitokondrial neuronal mund të çojë në aterosklerozë të hershme dhe rimodelim të 1C (Figura 3E dhe Figura S5C), dhe madje edhe ndryshime të parashikueshme në shprehjen e komplekseve I dhe IV, ndryshimet në sintezën serine de novo janë vetëm në fazat e vona. Mosfunksionimi i OXPHOS (Figura 3E dhe Figura S5C). Këto gjetje përcaktojnë një proces sekuencial në të cilin mitokondrialet e shkaktuara nga stresi (cikli 1C) dhe citoplazmatike (biosinteza e serinës) përgjigjen në mënyrë sinergjike me rritjen e aterosklerozës në ciklin TCA për të riformësuar metabolizmin neuronal.
PN-të 8-javëshe me mungesë të OXPHOS mund të ruajnë aktivitetin e ngacmimit me frekuencë të lartë dhe t'i nënshtrohen rilidhjes së konsiderueshme metabolike për të kompensuar mosfunksionimin mitokondrial. Ky zbulim ngre një mundësi interesante që edhe në këtë moment, këto qeliza mund të marrin gjithashtu ndërhyrje terapeutike për të vonuar ose parandaluar neurodegjenerimin. Vonë. Ne e zgjidhëm këtë mundësi përmes dy ndërhyrjeve të pavarura. Në metodën e parë, ne projektuam një vektor të virusit të adeno-shoqëruar (AAV) të varur nga Cre në mënyrë që MFN2 të mund të shprehet në mënyrë selektive në PN-të me mungesë të OXPHOS in vivo (Figura S7A). AAV që kodon MFN2 dhe gjeni raportues fluoreshent mCherry (Mfn2-AAV) u verifikuan në kulturat primare të neuroneve in vitro, gjë që bëri që MFN2 të shprehet në një mënyrë të varur nga Cre dhe shpëtoi morfologjinë mitokondriale, duke parandaluar kështu neuromutacionin në neuronet Mfn2cKO (Figura S7, B, D dhe E). Më pas, ne kryem eksperimente in vivo për të dhënë stereotaktikisht Mfn2-AAV 8-javësh në korteksin cerebelar të minjve Mfn2cKO dhe kontrollit, dhe analizuam minjtë 12-javësh (Figura 4A). Minjtë e trajtuar Mfn2cKO ngordhën (Figura 1, A dhe B) (16). Transduksioni viral in vivo rezultoi në shprehje selektive të PN në disa rrathë cerebelarë (Figura S7, G dhe H). Injektimi i AAV të kontrollit që shpreh vetëm mCherry (Ctrl-AAV) nuk pati efekt të rëndësishëm në shkallën e neurodegjenerimit në kafshët Mfn2cKO. Në të kundërt, analiza e Mfn2cKO-ve të transdukuara me Mfn2-AAV tregoi një efekt të rëndësishëm mbrojtës të shtresës qelizore PN (Figura 4, B dhe C). Në veçanti, dendësia e neuroneve duket se është pothuajse e padallueshme nga kafshët e kontrollit (Figura 4, B dhe C, dhe Figura S7, H dhe I). Shprehja e MFN1, por jo e MFN2, është po aq efektive në shpëtimin e vdekjes neuronale (Figura 4C dhe Figura S7, C dhe F), gjë që tregon se shprehja e MFN1 ektopike mund të plotësojë në mënyrë efektive mungesën e MFN2. Analiza e mëtejshme në nivelin e vetëm të PN tregoi se Mfn2-AAV shpëtoi kryesisht ultrastrukturën e mitokondrive, normalizoi nivelet e mtADN-së dhe përmbysi shprehjen e lartë të shënuesit PCx anti-angiogjenezë (Figura 4, C deri në E). Inspektimi vizual i minjve të shpëtuar Mfn2cKO në gjendje pushimi tregoi se qëndrimi i tyre dhe simptomat motorike (lëvizja S1 deri në S3) u përmirësuan. Si përfundim, këto eksperimente tregojnë se vonesa e rifutjes së MFN2 në PN me mungesë të madhe të OXPHOS është e mjaftueshme për të përmbysur konsumin e mtADN-së dhe për të shkaktuar aterosklerozë, duke parandaluar kështu degjenerimin e aksonit dhe vdekjen neuronale in vivo.
(A) Një skemë që tregon orarin eksperimental për injektimin e AAV që kodon MFN2 kur rruga metabolike e treguar aktivizohet. (B) Imazhe konfokale përfaqësuese të fetave cerebellare 12-javore të transduktuara në 8 javë në minj Mfn2cKO dhe të etiketuara me antitrupa anti-Calbindin. Djathtas: Shkallëzimi i fibrave të aksonit. Shkalla e zmadhimit të aksonit është 450 dhe 75 μm. (C) Majtas: Kuantifikimi i dendësisë së qelizave Purkinje në lakun e transduksionit AAV (AAV+) (analizë njëkahëshe e variancës; n = 3 minj). Djathtas: analiza e fokusit të mtADN-së në PN të transduktuar në javën 12 (testi t i paçiftuar; n = 6 qeliza nga tre minj). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Mikrografi përfaqësuese elektronike të transmetimit të PN-ve të seksioneve cerebellare Mfn2cKO të transduktuara me vektorët viralë të treguar. Maska rozë ilustron zonën e zënë nga dendritet, dhe katrori me pika të verdha ilustron zmadhimin e dhënë në të djathtë; n përfaqëson bërthamën. Shiriti i shkallës, 1μm. (E) tregon një shembull të ngjyrosjes PCx në PN të transdukuar në 12 javë. Shiriti i shkallës, 20μm. OE, mbishprehje; FC, ndryshim i palosjes.
Së fundmi, ne hetuam rëndësinë e mbijetesës së qelizave të induktuara nga peroksidaza në qelizat periferike që kanë përjetuar mosfunksionim të OXPHOS. Ne gjeneruam mCherry që kodon AAV-shRNA (ARN e shkurtër në formë harku) që synon posaçërisht mRNA-në e PCx të miut (AAV-shPCx), dhe injektuam virusin ose kontrollin e tij të fërkuar (AAV-scr) në trurin e vogël të minjve Mfn2cKO. Injeksioni u krye në javën e katërt të moshës (Figura 5A) për të arritur uljen efektive të PCx gjatë periudhës kur shprehja e PCx u rrit (Figura 3C) dhe shtresa e qelizave PN ishte ende e paprekur (Figura 1A). Vlen të përmendet se rrëzimi i PCx (Figura S8A) çon në një përshpejtim të ndjeshëm të vdekjes së PN, e cila është e kufizuar në unazën e infektuar (Figura 5, B dhe C). Për të kuptuar mekanizmin e efekteve metabolike të shkaktuara nga rritja e PCx, ne studiuam statusin redoks të PN-ve pasi ulja e PCx dhe biosensori optik i ndërmjetësuar nga AAV Grx1-roGFP2 u shprehën njëkohësisht (Figura S8, B deri në D) për të vlerësuar ndryshimin relativ të potencialit redoks të peptideve me glutation (38). Pastaj, ne kryem mikroskopinë imazherike të fluoreshencës së jetës me dy fotone (FLIM) në feta akute të trurit të Mfn2cKO 7-javësh ose të bashkëjetuesve të kontrollit për të zbuluar ndryshimet e mundshme në statusin redoks citoplazmatik pas verifikimit të kushteve FLIM (Figura S8, E deri në G). Analiza tregoi një rritje të konsiderueshme në gjendjen e oksidimit të një PN të vetëm Mfn2cKO që nuk kishte shprehje PCx, e cila është e ndryshme nga neuronet e kontrollit ose PN-të Mfn2cKO që shprehin vetëm shRNA të fërguara (Figura 5, D dhe E). Kur shprehja e PCx u ul, përqindja e PN-ve Mfn2cKO që tregonin një gjendje shumë të oksiduar u rrit me më shumë se tre herë (Figura 5E), duke treguar se rregullimi në rritje i PCx ruajti kapacitetin redoks të neuroneve të degjeneruara.
(A) Një skemë që tregon orarin eksperimental për injektimin e AAV që kodon shPCx kur rruga metabolike e treguar aktivizohet. (B) Fotografi konfokale përfaqësuese të seksioneve cerebellare 8-javore në minj Mfn2cKO të transdukuar dhe etiketuar me antitrup anti-kalcineurin në 4 javë. Shiriti i shkallës, 450μm. (C) Kuantifikimi i dendësisë së qelizave Purkinje në sythet e transdukuara nga AAV (analiza njëkahëshe e variancës; n = 3 deri në 4 minj). Të dhënat shprehen si mesatare ± SEM; ***P<0.001. (D) Fotografia përfaqësuese FLIM tregon jetëgjatësinë mesatare të PN 7-javore që shpreh sensorin redoks të glutationit Grx1-roGFP2 në kushtet e specifikuara eksperimentale. Raporti LUT (tabela e kërkimit): intervali kohor i mbijetesës (në pikosekonda). Shiriti i shkallës, 25μm. (E) Histograma tregon shpërndarjen e vlerave të jetëgjatësisë së Grx1-roGFP2 nga (D) (n=158 deri në 368 qeliza në dy minj në secilin kusht). Grafiku rrethor mbi secilin histogram: tregon numrin e qelizave me vlera jetëgjatësie dukshëm më të gjata (të kuqe, të oksiduara) ose më të shkurtra (blu, të reduktuara), të cilat tejkalojnë 1 SD të vlerës mesatare të jetëgjatësisë në CTRL-AAV-scr. (F) Modeli i propozuar tregon efektin mbrojtës të rritjes së PCx neuronale.
Në përgjithësi, të dhënat që ofrojmë këtu tregojnë se rishprehja e MFN2 mund ta shpëtojë plotësisht neuropatinë e përparuar me mungesë të rëndë të OXPHOS, pakësim të rëndë të mtADN-së dhe morfologji jashtëzakonisht anormale të ngjashme me ista-n, duke siguruar kështu përparim të vazhdueshëm edhe në sëmundjet e avancuara. Neurodegjenerimi ofron prova të kthyeshme të fazës para vdekjes qelizore. Kjo shkallë e fleksibilitetit metabolik theksohet më tej nga aftësia e neuroneve për të shkaktuar aterosklerozë (një rilidhje e ciklit TCA), e cila pengon shprehjen e PCx në neuropatitë e papërpunuara që nuk kanë OXPHOS dhe rrit vdekjen qelizore, duke luajtur kështu një rol mbrojtës (Figura 5F).
Në këtë studim, ne dhamë prova se përgjigja e PN-ve ndaj mosfunksionimit të OXPHOS është që gradualisht të konvergojë në aterosklerozën e ciklit TCA përmes rrugës së aktivizimit diferencial të aktivizuar nga programet metabolike. Ne konfirmuam analizën proteomike me shumë metoda plotësuese dhe zbuluam se kur sfidohen nga mosfunksionimi i rëndë mitokondrial, neuronet kanë një formë të panjohur më parë të elasticitetit metabolik. Për habinë tonë, i gjithë procesi i rilidhjes nuk shënon domosdoshmërisht gjendjen metabolike terminale që shoqëron neurodegjenerimin gradualisht dhe në mënyrë të pakthyeshme, por të dhënat tona sugjerojnë se ai mund të përbëjë një neuron mirëmbajtjeje edhe në fazën para vdekjes qelizore. Mekanizmi i kompensimit funksional. Ky zbulim tregon se neuronet kanë një shkallë të konsiderueshme të plasticitetit metabolik në trup. Ky fakt vërteton se rifutja e mëvonshme e MFN2 mund të përmbysë shprehjen e shënuesve kryesorë metabolikë dhe të parandalojë degjenerimin e PN. Përkundrazi, ajo pengon aterosklerozën dhe përshpejton nervat. transeksual.
Një nga gjetjet më interesante në hulumtimin tonë është se qelizat parazitare që nuk kanë OXPHOS mund të modifikojnë metabolizmin e ciklit TCA duke rritur enzimat që stimulojnë në mënyrë specifike arteriosklerozën. Rirregullimi metabolik është një tipar i zakonshëm i qelizave kancerogjene, disa prej të cilave mbështeten në glutaminë për të plotësuar ndërmjetësit e ciklit TCA për të prodhuar ekuivalentë reduktues, të cilët nxisin zinxhirin respirator dhe ruajnë prodhimin e pararendësve të biosintezës së lipideve dhe nukleotideve (39, 40). Një studim i kohëve të fundit tregoi se në indet periferike që përjetojnë mosfunksionim të OXPHOS, rilidhja e metabolizmit të glutaminës/glutamatit është gjithashtu një tipar i spikatur (5, 41), ku drejtimi i hyrjes së glutaminës në ciklin TCA varet nga (për shkak të ashpërsisë së dëmtimit të OXPHOS (41). Megjithatë, mungojnë prova të qarta mbi çdo ngjashmëri të plasticitetit metabolik neuronal në trup dhe rëndësinë e tij të mundshme në kontekstin e sëmundjes. Në një studim të kohëve të fundit in vitro, neuronet primare kortikale u treguan se mobilizojnë rezervat e glutamatit për neurotransmetim, duke nxitur kështu metabolizmin oksidativ dhe arteriosklerozën në kushte stresi metabolik (42). Vlen të përmendet se nën frenimin farmakologjik të enzimës së ciklit TCA, sukcinat dehidrogjenaza, besohet se karboksilimi i piruvatit ruan sintezën e oksaloacetatit në neuronet e granulave cerebelare të kultivuara (34). Megjithatë, rëndësia fiziologjike e këtyre mekanizmave për indin e trurit (ku besohet se ateroskleroza kufizohet kryesisht në astrocite) ende ka rëndësi të rëndësishme fiziologjike (43). Në këtë rast, të dhënat tona tregojnë se PN-të e dëmtuara nga OXPHOS në trup mund të kalojnë në degradim të BCAA-së dhe karboksilim të piruvatit, të cilat janë dy burimet kryesore të plotësimit të ndërmjetësve të pishinës TCA. Megjithëse është propozuar kontributi i supozuar i katabolizmit të BCAA-së në metabolizmin e energjisë neuronale, përveç rolit të glutamatit dhe GABA-s për neurotransmetim (44), ende nuk ka prova për këto mekanizma in vivo. Prandaj, është e lehtë të spekulohet se PN-të jofunksionale mund të kompensojnë automatikisht konsumin e ndërmjetësve TCA të nxitur nga procesi i asimilimit duke rritur aterosklerozën. Në veçanti, rritja e nivelit të PCx mund të jetë e nevojshme për të ruajtur një kërkesë në rritje për acid aspartik, gjë që sugjerohet në qelizat proliferuese me mosfunksionim mitokondrial (45). Megjithatë, analiza jonë metabolomike nuk zbuloi ndonjë ndryshim të rëndësishëm në nivelin e gjendjes së qëndrueshme të acidit aspartik në qelizat e qelizave të mitokondriale Mfn2cKO (Figura S6A), e cila me sa duket pasqyron shfrytëzimin e ndryshëm metabolik të acidit aspartik midis qelizave proliferuese dhe neuroneve post-mitotike. Megjithëse mekanizmi i saktë i rritjes së nivelit të PCx në neuronet jofunksionale in vivo mbetet për t'u karakterizuar, ne demonstruam se kjo përgjigje e parakohshme luan një rol të rëndësishëm në ruajtjen e gjendjes redoks të neuroneve, gjë që u demonstrua në eksperimentet FLIM në feta cerebelare. Në veçanti, parandalimi i rritjes së nivelit të PCx nga qelizat e mitokondriale mund të çojë në një gjendje më të oksiduar dhe të përshpejtojë vdekjen qelizore. Aktivizimi i degradimit të BCAA dhe karboksilimi i piruvatit nuk janë mënyra për të karakterizuar indet periferike të mosfunksionimit mitokondrial (7). Prandaj, ato duket se janë një tipar prioritar i neuroneve me mungesë të OXPHOS, edhe nëse jo tipari i vetëm, i cili është i rëndësishëm për neurodegjenerimin.
Sëmundja cerebelare është një lloj heterogjen i sëmundjes neurodegjenerative që zakonisht manifestohet si ataksi dhe shpesh dëmton qelizat cerebellare (PN) (46). Kjo popullatë neuronesh është veçanërisht e ndjeshme ndaj mosfunksionimit mitokondrial sepse degjenerimi i tyre selektiv tek minjtë është i mjaftueshëm për të riprodhuar shumë nga simptomat motorike që karakterizojnë ataksinë spinocerebellare njerëzore (16, 47, 48). Sipas raporteve, një model transgjenik miu me një gjen mutant është i lidhur me ataksinë spinocerebellare njerëzore dhe ka mosfunksionim mitokondrial (49, 50), duke theksuar rëndësinë e studimit të pasojave të mungesës së OXPHOS në PNPH. Prandaj, është veçanërisht i përshtatshëm për të izoluar dhe studiuar në mënyrë efektive këtë popullatë unike neuronesh. Megjithatë, duke pasur parasysh që PN-të janë shumë të ndjeshme ndaj presionit dhe përbëjnë një pjesë të ulët të të gjithë popullatës së qelizave cerebellare, për shumë studime të bazuara në omikë, ndarja selektive e tyre si qeliza të tëra është ende një aspekt sfidues. Edhe pse është pothuajse e pamundur të arrihet mungesa absolute e kontaminimit të llojeve të tjera të qelizave (veçanërisht indeve të të rriturve), ne kombinuam një hap efektiv të disociimit me FACS për të marrë një numër të mjaftueshëm të neuroneve të qëndrueshme për analizën e proteomikës në rrjedhën e poshtme, dhe kemi një mbulim mjaft të lartë të proteinave (rreth 3000 proteina) krahasuar me të dhënat ekzistuese të të gjithë trurit të vogël (51). Duke ruajtur qëndrueshmërinë e qelizave të tëra, metoda që ofrojmë këtu na lejon jo vetëm të kontrollojmë ndryshimet në rrugët metabolike në mitokondri, por edhe të kontrollojmë ndryshimet në homologët e saj citoplazmatikë, gjë që plotëson përdorimin e etiketave të membranës mitokondriale për të pasuruar llojin e qelizës. Metoda e re për numrin e mitokondrive në indet komplekse (52, 53). Metoda që përshkruajmë nuk lidhet vetëm me studimin e qelizave Purkinje, por mund të aplikohet lehtësisht në çdo lloj qelize për të adresuar ndryshimet metabolike në trurin e sëmurë, duke përfshirë modele të tjera të mosfunksionimit mitokondrial.
Së fundmi, ne kemi identifikuar një dritare terapeutike gjatë këtij procesi të rirregullimit metabolik që mund të përmbysë plotësisht shenjat kryesore të stresit qelizor dhe të parandalojë degjenerimin neuronal. Prandaj, të kuptuarit e implikimeve funksionale të rilidhjes së përshkruar këtu mund të ofrojë njohuri themelore mbi trajtimet e mundshme për ruajtjen e qëndrueshmërisë neuronale gjatë mosfunksionimit mitokondrial. Kërkimet e ardhshme që synojnë analizimin e ndryshimeve në metabolizmin e energjisë në lloje të tjera të qelizave të trurit janë të nevojshme për të zbuluar plotësisht zbatueshmërinë e këtij parimi në sëmundjet e tjera neurologjike.
Minjtë MitoPark janë përshkruar më parë (31). Minjtë C57BL/6N me gjene Mfn2 që i bashkohen loxP janë përshkruar më parë (18) dhe janë kryqëzuar me minj L7-Cre (23). Pasardhësit e dyfishtë heterozigotë që rezultuan u kryqëzuan më pas me minj homozigotë Mfn2loxP/Mfn2loxP për të gjeneruar nokaut të gjenit specifik Purkinje për Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Në një nëngrup çiftëzimi, aleli Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) u fut përmes kryqëzimeve shtesë (20). Të gjitha procedurat e kafshëve u kryen në përputhje me udhëzimet evropiane, kombëtare dhe institucionale dhe u miratuan nga LandesamtfürNatur i Umwelt dhe Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Gjermani. Puna me kafshët ndjek gjithashtu udhëzimet e Federatës Evropiane të Shoqatave të Shkencave të Kafshëve Laboratorike.
Pas anestezisë së zhvendosjes cervikale të gruas shtatzënë, embrioni i miut është izoluar (E13). Korteksi u disektua në Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) të plotësuar me 10 mM Hepes dhe u kalua në Dulbecco's Modified Eagle's Medium që përmban papainë (20 U/ml) dhe cisteinë (1μg/ml). Inkuboni indin në DMEM) dhe shkëputeni atë me anë të tretjes enzimatike. Ml) në 37°C për 20 minuta, dhe më pas bluani mekanikisht në DMEM të plotësuar me 10% serum fetal të gjedhit. Qelizat u mbjellën në mbulesa qelqi të veshura me polilizinë me një dendësi prej 2×106 për enë kulture 6 cm ose me një dendësi prej 0.5×105 qeliza/cm2 për analizë imazherike. Pas 4 orësh, mediumi u zëvendësua me medium pa serum Neurobasal që përmbante 1% shtesë B27 dhe 0.5 mM GlutaMax. Neuronet u mbajtën më pas në 37°C dhe 5% CO2 gjatë gjithë eksperimentit dhe u ushqyen një herë në javë. Për të nxitur rekombinimin in vitro, 3μl (pjatë kulture me 24 puseta) ose 0.5μl (pllakë me 24 puseta) e vektorit të mëposhtëm të virusit AAV9 u përdor për të trajtuar neuronet në ditën e dytë in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, numri i katalogut 105530-AAV9) dhe AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, numri i katalogut 105545-AAV9).
ADN-ja plotësuese Mfn1 dhe Mfn2 e miut (e marrë nga plazmidet Addgene #23212 dhe #23213, përkatësisht) është shënuar me sekuencën V5 (GKPIPNPLLGLDST) në skajin C-terminal dhe është bashkuar me mCherry në kornizë përmes sekuencës T2A. Grx1-roGFP2 është një dhuratë nga Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Duke zëvendësuar kasetën tdTomato duke përdorur metoda konvencionale të klonimit, kaseta u nënklonua në shtyllën kurrizore pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (numri i referencës Addgene 28306) për të gjeneruar vektorët pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 dhe pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Një strategji e ngjashme u përdor për të gjeneruar vektorin e kontrollit pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Për të gjeneruar konstruktin AAV-shPCx, kërkohet një vektor plazmid AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), i cili përmban sekuencën e ADN-së që kodon shRNA-në që synon PCx-në e miut (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Nën kontrollin e promotorit U6, mCherry përdoret nën kontrollin e promotorit CMV. Prodhimi i vektorëve ndihmës AAV u krye sipas udhëzimeve të prodhuesit (Cell Biolabs). Shkurt, përdorni një plazmid transferimi që mbart mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) transfektim kalimtar të qelizave 293AAV-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ose gjenit kodues Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), si dhe kodimin e proteinës kapsidike AAV1 dhe plazmidit paketues të proteinës ndihmëse, duke përdorur metodën e fosfatit të kalciumit. Supernatanti i papërpunuar i virusit u mor me anë të cikleve të ngrirjes-shkrirjes në një banjë akulli të thatë/etanoli dhe qelizat e lizuara në tretësirë ​​fiziologjike të tamponuar me fosfat (PBS). Vektori AAV u pastrua me anë të ultracentrifugimit të pandërprerë me gradient jodiksanoli (24 orë në 32,000 rpm dhe 4°C) dhe u përqendrua duke përdorur një filtër centrifugal Amicon ultra-15. Titri i gjenomit të AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 kopje e gjenomit (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX u përshkrua siç është përshkruar më parë (54), i matur me PCR sasiore në kohë reale (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) dhe AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml).
Neuronet primare u gërryen në 1x PBS të ftohtë me akull, u peletuan dhe më pas u homogjenizuan në tampon lize 0.5% Triton X-100 / 0.5% deoksikolat natriumi/PBS që përmbante fosfatazë dhe frenues të proteazës (Roche). Përcaktimi sasior i proteinave u krye duke përdorur analizën e acidit bicinchoninic (Thermo Fisher Scientific). Proteinat më pas u ndanë me anë të elektroforezës së xhelit SDS-poliakrilamid dhe më pas u blotuan në një membranë fluoride poliviniliden (GE Healthcare). Bllokoni vendet jo-specifike dhe inkuboni me antitrupin primar (shih Tabelën S1 për detaje) në qumësht 5% në TBST (tretësirë ​​fiziologjike e tamponuar me Tris me Tween), hapat e larjes dhe antitrupin sekondar në inkubatorin TBST. Inkuboni me antitrupin primar gjatë natës në +4°C. Pas larjes, aplikoni antitrupin sekondar për 2 orë në temperaturën e dhomës. Më pas, duke inkubuar të njëjtin blot me një antitrup anti-β-aktinë, u konfirmua e njëjta ngarkesë. Zbulimi duke u konvertuar në kemilumineshencë dhe duke rritur kemilumineshencën (GE Healthcare).
Neuronet e mbjella më parë në mbulesa qelqi u fiksuan me 4% paraformaldehidë (PFA)/PBS në pikën e caktuar kohore në temperaturën e dhomës për 10 minuta. Mbulesat fillimisht përshkohen me 0.1% Triton X-100/PBS për 5 minuta në temperaturën e dhomës dhe më pas në tampon bllokues [3% albuminë serumi gjedhi (BSA)/PBS]. Në ditën e dytë, mbulesat u lanë me tampon bllokues dhe u inkubuan me antitrupin sekondar të konjuguar me fluorofor të përshtatshëm për 2 orë në temperaturën e dhomës; së fundmi, mostrat u lanë plotësisht në PBS me 4′,6-diamidino-2-Phenylindole (DAPI) të ngjyrosur kundër dhe më pas u fiksuan në lamin e mikroskopit me Aqua-Poly/Mount.
Minjtë (meshkuj dhe femra) u anestezuan me injeksion intraperitoneal të ketaminës (130 mg/kg) dhe ksilazinës (10 mg/kg) dhe u administruan në mënyrë nënlëkurore me analgjezik karprofen (5 mg/kg). Dhe u vendosën në një instrument stereotaktik (Kopf) të pajisur me një jastëk të ngrohtë. Ekspozoni kafkën dhe përdorni një trapan dentar për të holluar pjesën e korteksit cerebellar që korrespondon me kockën mis (nga lambda: bishti 1.8, lateral 1, që korrespondon me lobulat IV dhe V). Përdorni një gjilpërë shiringe të lakuar për të krijuar me kujdes një vrimë të vogël në kafkë për të shmangur prishjen e enëve të gjakut poshtë. Pastaj kapilari i hollë prej qelqi futet ngadalë në mikro-vrimën (nga -1.3 në -1 në anën ventrale të dura mater), dhe 200 deri në 300 nl AAV injektohet në mikro-injektor (Narishige) me shiringa manuale (Narishige) disa herë me presion të ulët gjatë një periudhe kohore prej 10 deri në 20 minutash. Pas infuzionit, vendoseni kapilarin për 10 minuta të tjera që virusi të përhapet plotësisht. Pasi të tërhiqen kapilarët, lëkura qepet me kujdes për të minimizuar inflamacionin e plagës dhe për t'i lejuar kafshës të shërohet. Kafshët u trajtuan me analgjezikë (caspofen) për disa ditë pas operacionit, gjatë së cilës kohë gjendja e tyre fizike u monitorua me kujdes dhe më pas u eutanizuan në pikën e caktuar kohore. Të gjitha procedurat u kryen në përputhje me udhëzimet evropiane, kombëtare dhe institucionale dhe u miratuan nga LandesamtfürNatur i Umwelt dhe Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Gjermani.
Kafshët u anestezuan me ketaminë (100 mg/kg) dhe ksilazinë (10 mg/kg), dhe zemra u perfuzua fillimisht me 0.1 M PBS, dhe më pas me 4% PFA në PBS. Indi u disektua dhe u fiksua në 4% PFA/PBS gjatë natës në 4°C. Një thikë vibruese (Leica Microsystems GmbH, Vjenë, Austri) u përdor për të përgatitur prerje sagitale (50 μm të trasha) nga truri i fiksuar në PBS. Nëse nuk specifikohet ndryshe, ngjyrosja e prerjeve të lira lundruese u krye siç përshkruhet më sipër (13) në temperaturë ambienti dhe duke i përzier. Shkurt, së pari, fetat e përftuara u përshkuan me 0.5% Triton X-100/PBS për 15 minuta në temperaturë ambienti; për disa epitope (Pcx dhe Shmt2), duke përdorur në tampon tris-EDTA në 80°C (PH 9) ngrohni fetat për 25 minuta në vend të këtij hapi. Më pas, seksionet u inkubuan me antitrupin primar (shih Tabelën S1) në tampon bllokues (3% BSA/PBS) në 4°C gjatë natës duke u përzier. Të nesërmen, seksionet u lanë me tampon bllokues dhe u inkubuan me antitrupin sekondar të konjuguar me fluorofor të përshtatshëm për 2 orë në temperaturë ambienti; së fundmi, seksionet u lanë plotësisht në PBS, u ngjyrosën me DAPI dhe më pas u fiksuan me AquaPolymount në një lamë mikroskopi.
Një mikroskop konfokal skanues me lazer (TCS SP8-X ose TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) i pajisur me një lazer me dritë të bardhë dhe një lazer ultraviolet me diodë 405 u përdor për të imazhuar mostrën. Duke ngacmuar fluoroforin dhe duke mbledhur sinjalin me Detektorin Hibrid (HyDs), softueri LAS-X u përdor për të mbledhur imazhe të grumbulluara në përputhje me marrjen e mostrave Nyquist në modalitetin sekuencial: për panelet jo-sasiore, janë sinjale shumë dinamike (për shembull, në qelizat somatike dhe dendritet) mtYFP (Përdorni HyD për të zbuluar numrin e PN-ve në modalitetin BrightR). Gating nga 0.3 në 6 ns zbatohet për të zvogëluar sfondin.
Imazheria në kohë reale e qelizave të renditura. Pas renditjes në mjedisin Neurobasal-A që përmbante 1% suplement B27 dhe 0.5 mM GlutaMax, qelizat u mbjellën menjëherë në laminat prej qelqi të veshura me poli-l-lizinë (μ-Slide8 Well, Ibidi, numri i katalogut 80826). Më pas u mbajtën në 37°C dhe 5% CO2 për 1 orë që qelizat të stabilizoheshin. Imazheria në kohë reale u krye në një mikroskop konfokal skanues me lazer Leica SP8 të pajisur me një lazer të bardhë, HyD, lente objektivi vaji 63×[1.4 aperturë numerike (NA)] dhe një fazë ngrohjeje.
Miu u anestezua shpejt me dioksid karboni dhe iu dekapitua koka, truri u hoq shpejt nga kafka dhe u pre në seksion sagittal me trashësi 200μm (për eksperimentin e etiketimit 13C) ose 275μm (për eksperimentet me dy fotone) të mbushur me materialet e mëposhtme. Akullorja (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Gjermani) është e mbushur me substancat e mëposhtme: 125 mM lëng artificial cerebrospinal (ACSF) i ftohtë me akull, i ngopur me karbon (95% O2 dhe 5% CO2) me përmbajtje të ulët Ca2 + NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM tampon fosfati natriumi, 25 mM NaHCO3, 25 mM glukozë, 0.5 mM CaCl2 dhe 3.5 mM MgCl2 (presioni osmotik nga 310 deri në 330 mmol). Transferoni fetat e trurit të përftuara në një dhomë para-inkubimi që përmban Ca2 + ACSF më të lartë (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM tampon fosfati natriumi, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukozë, 1.0 mM CaCl2 dhe 2.0 mM MgCl2) Mjedis (pH 7.4 dhe 310 deri në 320 mmol).
Gjatë procesit të imazherisë, prerjet u zhvendosën në një dhomë të dedikuar imazherie dhe eksperimenti u krye nën perfuzion të vazhdueshëm ACSF në një temperaturë konstante prej 32° deri në 33°C. Për imazherinë e prerjeve u përdor një mikroskop skanues me lazer shumëfotonësh (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) i pajisur me një lente objektivi Leica 25x (NA 0.95, ujë), lazer Ti: Safir (Chameleon Vision II, Coherent). Moduli FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM i Grx1-roGFP2. Ndryshimet në gjendjen redoks citoplazmatike të PN-ve u matën me FLIM me dy fotone në feta sagitale të trurit, ku biosensori Grx1-roGFP2 shënjestroi PN-të. Në shtresën PN, fusha e marrjes zgjidhet rreth 50 deri në 80 μm nën sipërfaqen e fetës për të siguruar që ekziston një PN i qëndrueshëm (domethënë, mungesa e strukturës së rruazave ose ndryshimeve morfologjike neuronale përgjatë dendriteve) dhe sensori roGFP2 pozitiv i dyfishtë dhe AAV që kodojnë shRNA PCx ose sekuencën e saj të kontrollit (secili që bashkë-shpreh mCherry). Mblidhni imazhe me një pirg me zmadhim dixhital 2x [gjatësia e valës së ngacmimit: 890 nm; 512 nm 512 piksel]. Zbulimi: HyD i brendshëm, grupi i filtrit të izotiocianatit të fluoresceinës (FITC)] dhe mesatarizimi i imazhit brenda 2 deri në 3 minutash përdoren për të siguruar që të mblidhen fotone të mjaftueshme (1000 fotone në total) për përshtatjen e kurbës. Ndjeshmëria e sondës Grx1-roGFP2 dhe verifikimi i kushteve FLIM u kryen duke monitoruar vlerën e jetëgjatësisë së roGFP2 kur shtohej 10 mM H2O2 ekzogjen në ACSF të perfuzionit (për të maksimizuar oksidimin, duke rezultuar në rritje të jetëgjatësisë), dhe më pas duke shtuar 2 mM ditiotreitol (minimizon shkallën e reduktimit, duke rezultuar në një ulje të jetëgjatësisë) (Figura S8, D deri në G). Përdorni softuerin FLIMfit 5.1.1 për të analizuar rezultatet e fituara, përshtatni kurbën e vetme të zbërthimit eksponencial të të gjithë imazhit me IRF-në e matur (funksioni i përgjigjes së instrumentit) dhe χ2 është afërsisht 1. Për të llogaritur jetëgjatësinë e një PN të vetëm, maska ​​rreth trupit nervor u vizatua manualisht, dhe jetëgjatësia mesatare në secilën maskë u përdor për përcaktim sasior.
Analiza e potencialit mitokondrial. Pasi seksioni akut u inkubua me 100 nM TMRM të shtuar direkt në ACSF të perfuzuar për 30 minuta, ndryshimet e potencialit mitokondrial të PN-ve u matën me një mikroskop me dy fotone. Imazheria TMRM u krye duke eksituar sondën në 920 nm dhe duke përdorur HyD të brendshëm (tetrametilrodaminë izotiocianat: 585/40 nm) për të mbledhur sinjale; duke përdorur të njëjtën gjatësi vale ngacmimi, por duke përdorur një HyD të brendshëm të ndryshëm (FITC: 525/50) për të imazhuar mtYFP. Përdorni shtesën Image Calculator të ImageJ për të vlerësuar potencialin mitokondrial në nivelin e një qelize të vetme. Shkurt, ekuacioni i shtesës: sinjali = min (mtYFP, TMRM) përdoret për të identifikuar rajonin mitokondrial që tregon sinjalin TMRM në Purkinje Somali në imazhin konfokal me një pirg të kanalit përkatës. Pastaj, zona e pikselit në maskën që rezulton përcaktohet sasiorisht dhe më pas normalizohet në imazhin përkatës të pragut me një grumbull të vetëm të kanalit mtYFP për të marrë fraksionin mitokondrial që tregon potencialin mitokondrial.
Imazhi u dekovoltua me programin Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Për fotografitë e skanuara të pllakave, montimi i një pllake të vetme bëhet duke përdorur algoritmin automatik të qepjes të ofruar nga programi LAS-X. Pas kalibrimit të imazhit, përdorni ImageJ dhe Adobe Photoshop për të përpunuar më tej imazhin dhe për të rregulluar në mënyrë uniforme shkëlqimin dhe kontrastin. Përdorni Adobe Illustrator për përgatitjen grafike.
Analiza e fokusit të mtADN-së. Numri i lezioneve të mtADN-së u përcaktua në seksionet cerebelare të etiketuara me antitrupa kundër ADN-së me anë të mikroskopit konfokal. Çdo zonë e synuar u krijua për trupin e qelizës dhe bërthamën e secilës qelizë, dhe zona përkatëse u llogarit duke përdorur shtojcën Multi Measure (softueri ImageJ). Zbritni zonën bërthamore nga zona e trupit të qelizës për të marrë zonën citoplazmike. Së fundmi, shtojca Analyze Particles (softueri ImageJ) u përdor për të përcaktuar automatikisht pikat e ADN-së citoplazmike që tregojnë mtADN-në në imazhin e pragut, dhe rezultatet e marra u normalizuan në mesataren PN të minjve CTRL. Rezultatet shprehen si numri mesatar i nukleozideve për qelizë.
Analiza e shprehjes së proteinave. Përdorni shtojcën Image Calculator të ImageJ për të vlerësuar shprehjen e proteinave në PN në nivelin e një qelize të vetme. Shkurt, në imazhin konfokal me një shtresë të vetme të kanalit përkatës, përmes ekuacionit: sinjal = min (mtYFP, antitrup), identifikohet rajoni mitokondrial që tregon imunoreaktivitet ndaj një antitrupi të caktuar në Purkina. Pastaj zona e pikselit në maskën që rezulton përcaktohet në mënyrë sasiore dhe më pas normalizohet në imazhin përkatës me një shtresë të vetme të pragut të kanalit mtYFP për të marrë fraksionin mitokondrial të proteinës së shfaqur.
Analiza e dendësisë së qelizave Purkinje. Shtesa Cell Counter e ImageJ u përdor për të vlerësuar dendësinë Purkinje duke pjesëtuar numrin e qelizave Purkinje të numëruara me gjatësinë e unazës cerebelare të zënë nga qelizat e numëruara.
Përgatitja dhe mbledhja e mostrës. Truri nga grupi i kontrollit dhe minjtë Mfn2cKO u fiksuan në 2% PFA/2.5% glutaraldehid në tampon fosfati 0.1 M (PB), dhe më pas prerjet koronale u përgatitën duke përdorur ciliate (Leica Mikrosysteme GmbH, Vjenë, Austri) (Trashësia 50 deri në 60 μm). Më pas u fiksuan në tampon PB në 1% tetraoksid os dhe 1.5% ferocianid kaliumi në temperaturë ambienti për 1 orë. Prerjet u lanë tre herë me ujë të distiluar dhe më pas u ngjyrosën me 70% etanol që përmbante 1% acetat uranil për 20 minuta. Prerjet më pas u dehidratuan në alkool të graduar dhe u futën në rrëshirë epoksi Durcupan ACM (Araldite casting resin M) (Electron Microscopy Sciences, numri i katalogut 14040) midis lamellave prej qelqi të veshura me silikon, dhe së fundmi në 60°C u polimerizuan në furrë për 48 orë. Zona e korteksit cerebelar u zgjodh dhe seksione ultra të holla 50 nm u prenë në Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vjenë, Austri) dhe u morën në një rrjetë të çarë bakri 2×1 mm të veshur me film polistireni. Seksionet u ngjyrosën me një tretësirë ​​prej 4% acetat uranili në H2O për 10 minuta, u lanë me H2O disa herë, pastaj me citrat plumbi Reynolds në H2O për 10 minuta dhe më pas u lanë me H2O disa herë. Mikrografitë u morën me një mikroskop elektronik transmetues Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SHBA) duke përdorur një kamerë dixhitale TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, SHBA). Gjermani).
Për minjtë e infektuar me AAV, truri u nda dhe u pre në një prerje sagitale me trashësi 1 mm, dhe truri i vogël u ekzaminua duke përdorur një mikroskop fluoreshent për të identifikuar unazën e infektuar me AAV (domethënë, që shpreh mCherry). Përdoren vetëm eksperimente në të cilat injektimi i AAV rezulton në një efikasitet shumë të lartë të transduksionit të shtresës së qelizave Purkinje (domethënë pothuajse të gjithë shtresën) në të paktën dy unaza cerebelare të njëpasnjëshme. Laku i transdukuar nga AAV u mikrodisektua për fiksim pas natës (4% PFA dhe 2.5% glutaraldehid në tampon kokaoti 0.1 M) dhe u përpunua më tej. Për ngulitjen e EPON, indi i fiksuar u larë me tampon kokaoti natriumi 0.1 M (Applichem) dhe u inkubua me 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) në tampon kokaoti natriumi 0.1 M (Applichem) për 4 orë, pastaj u larë për 2 orë. Përsëriteni 3 herë me tampon kokamid 0.1 M. Më pas, seria ngjitëse e etanolit u përdor për të inkubuar secilën tretësirë ​​etanoli në 4°C për 15 minuta për të dehidratuar indin. Indi u transferua në oksid propileni dhe u inkubua gjatë natës në EPON (Sigma-Aldrich) në 4°C. Vendoseni indin në EPON të freskët në temperaturë ambienti për 2 orë dhe më pas vendoseni në 62°C për 72 orë. Përdorni një ultramikrotom (Leica Microsystems, UC6) dhe një thikë diamanti (Diatome, Biel, Zvicër) për të prerë seksione ultra të holla 70 nm dhe ngjyrosni me 1.5% acetat uranili për 15 minuta në 37°C dhe ngjyrosni me tretësirë ​​citrat plumbi për 4 minuta. Mikrografitë elektronike u morën duke përdorur një mikroskop elektronik transmetues JEM-2100 Plus (JEOL) të pajisur me Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) dhe softuerin DigitalMicrograph (Gatan). Për analizë, mikrografët elektronikë u morën me zmadhim dixhital 5000× ose 10,000×.
Analiza morfologjike e mitokondrive. Për të gjitha analizat, konturet e mitokondrive individuale u përvijuan manualisht në imazhe dixhitale duke përdorur programin ImageJ. Janë analizuar parametra të ndryshëm morfologjikë. Dendësia mitokondriale shprehet si përqindje e përftuar duke pjesëtuar sipërfaqen totale mitokondriale të secilës qelizë me sipërfaqen e citoplazmës (sipërfaqja e citoplazmës = sipërfaqja e qelizës - sipërfaqja e bërthamës së qelizës) × 100. Rrumbullakimi i mitokondrive llogaritet me formulën [4π∙(sipërfaqja/perimetri 2)]. Morfologjia e mitokondrive u analizua dhe u nda në dy kategori ("tubulare" dhe "flluskë") sipas formave të tyre kryesore.
Analiza e numrit dhe dendësisë së autofagozomit/lizozomit. Përdorni programin ImageJ për të përvijuar manualisht konturet e secilit autofagozom/lizozom në imazhin dixhital. Sipërfaqja e autofagozomit/lizozomit shprehet si përqindje e llogaritur duke pjesëtuar sipërfaqen totale të strukturës së autofagozomit/lizozomit të secilës qelizë me sipërfaqen e citoplazmës (sipërfaqja e citoplazmës = sipërfaqja e qelizës - sipërfaqja e bërthamës) × 100. Dendësia e autofagozomeve/lizozomeve llogaritet duke pjesëtuar numrin total me numrin e strukturave të autofagozomit/lizozomit për qelizë (në terma të sipërfaqes citoplazmatike) (sipërfaqja citoplazmike = sipërfaqja e qelizës - sipërfaqja e bërthamës).
Etiketimi për prerjen akute dhe përgatitjen e mostrës. Për eksperimentet që kërkojnë etiketimin me glukozë, transferoni fetat akute të trurit në një dhomë para-inkubimi, e cila përmban karbon të ngopur (95% O2 dhe 5% CO2), Ca2 + ACSF të lartë (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM tampon fosfati natriumi, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukozë, 1.0 mM CaCl2 dhe 2.0 mM MgCl2, të rregulluar në pH 7.4 dhe 310 deri në 320 mOsm), në të cilën glukoza është 13C6- Zëvendësimi i glukozës (Eurisotop, numri i katalogut CLM-1396). Për eksperimentet që kërkojnë etiketim me piruvat, transferoni fetat akute të trurit në Ca2 + ACSF më të lartë (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM tampon fosfati natriumi, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukozë, 1.0 mM CaCl2 dhe shtoni 2.0 mM MgCl2, rregulloni në pH 7.4 dhe 310 deri në 320mOsm), dhe shtoni 1mM 1-[1-13C]piruvat (Eurisotop, numri i katalogut CLM-1082). Inkuboni fetat për 90 minuta në 37°C. Në fund të eksperimentit, fetat u lanë shpejt me një tretësirë ​​ujore (pH 7.4) që përmbante 75 mM karbonat amoniumi, dhe më pas u homogjenizuan në 40:40:20 (v:v:v) acetonitril (ACN): metanol: ujë. Pasi seksionet u inkubuan në akull për 30 minuta, mostrat u centrifuguan në 21,000 g për 10 minuta në 4°C, dhe supernatanti i kthjellët u tha në një koncentrator SpeedVac. Peleta e tharë e metabolitit që rezultoi u ruajt në -80°C deri në analizë.
Analiza e kromatografisë së lëngshme-spektrometrisë masive e 13 aminoacideve të shënuara me C. Për analizën e kromatografisë së lëngshme-spektrometrisë masive (LC-MS), peleti i metabolitit u risuspendua në 75 μl ujë të gradës LC-MS (Honeywell). Pas centrifugimit në 21,000 g për 5 minuta në 4°C, 20 μl të supernatantit të sqaruar u përdorën për analizën e fluksit të aminoacideve, ndërsa pjesa tjetër e ekstraktit u përdor menjëherë për analizën e anioneve (shih më poshtë). Analiza e aminoacideve u krye duke përdorur protokollin e derivatizimit të klorurit të benzoilit të përshkruar më parë (55, 56). Në hapin e parë, 10 μl karbonat natriumi 100 mM (Sigma-Aldrich) u shtua në 20 μl ekstrakt metaboliti, dhe më pas 10 μl klorur benzoil 2% (Sigma-Aldrich) u shtua në ACN të gradës LC. Mostra u përzie shkurtimisht në vorteks dhe më pas u centrifugua në 21,000 g për 5 minuta në 20°C. Transferoni supernatantin e pastruar në një shishe automostruese 2 ml me një futje qelqi konike (vëllimi 200 μl). Mostrat u analizuan duke përdorur sistemin LC me performancë ultra të lartë Acquity iClass (Waters) të lidhur me spektrometrin masiv me precizion të lartë Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Për analizë, 2 μl e mostrës së derivatizuar u injektuan në një kolonë silici T3 me rezistencë të lartë 100×1.0 mm (Waters) që përmban grimca 1.8 μm. Shkalla e rrjedhjes është 100 μl/min, dhe sistemi tampon përbëhet nga tamponi A (10 mM format amoni dhe 0.15% acid formik në ujë) dhe tamponi B (ACN). Gradienti është si më poshtë: 0%B në 0 minuta; 0%B. 0 deri në 15% B në 0 deri në 0.1 minuta; 15 deri në 17% B në 0.1 deri në 0.5 minuta; B në 17 deri në 55% në 0.5 deri në 14 minuta; B në 55 deri në 70% në 14 deri në 14.5 minuta; në 14.5 deri në 70 deri në 100% B në 18 minuta; 100% B në 18 deri në 19 minuta; 100 deri në 0% B në 19 deri në 19.1 minuta; 0% B në 19.1 deri në 28 minuta (55, 56). Spektrometri i masës QE-HF funksionon në modalitetin e jonizimit pozitiv me një diapazon mase m/z (raporti masë/ngarkesë) prej 50 deri në 750. Rezolucioni i aplikuar është 60,000, dhe objektivi jonik i kontrollit të fitimit (AGC) i përftuar është 3×106, dhe koha maksimale e jonit është 100 milisekonda. Burimi i nxehtë i jonizimit me elektrospërkatje (ESI) funksionon me një tension spërkatjeje prej 3.5 kV, një temperaturë kapilare prej 250°C, një rrjedhë ajri të mbështjellësit prej 60 AU (njësi arbitrare) dhe një rrjedhë ajri ndihmëse prej 20 AU. 250°C. Lentja S është vendosur në 60 AU.
Analiza e kromatografisë anionike-MS e acideve organike të shënuara me 13C. Precipitati i mbetur i metabolitit (55μl) u analizua duke përdorur një sistem kromatografie jonik Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) të lidhur me një spektrometër masiv QE-HF (Thermo Fisher Scientific). Shkurt, 5μl ekstrakt metaboliti u injektuan në një kolonë Dionex IonPac AS11-HC të pajisur me HPLC (2 mm×250 mm, madhësia e grimcave 4μm, Thermo Fisher Scientific) në modalitetin e lakimit të pjesshëm me shtytje me një raport mbushjeje prej 1. ) Kolonë mbrojtëse Dionex IonPac AG11-HC (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific). Temperatura e kolonës mbahet në 30°C, dhe automomentori është vendosur në 6°C. Përdorni një fishek hidroksidi kaliumi të pajisur me ujë të deionizuar për të gjeneruar një gradient hidroksidi kaliumi përmes gjeneratorit të eluentit. Ndarja e metabolitëve me një shpejtësi rrjedhjeje prej 380 μl/min, duke aplikuar gradientin e mëposhtëm: 0 deri në 3 minuta, 10 mM KOH; 3 deri në 12 minuta, 10 deri në 50 mM KOH; 12 deri në 19 minuta, 50 deri në 100 mM KOH; 19 deri në 21 minuta, 100 mM KOH; 21 deri në 21.5 minuta, 100 deri në 10 mM KOH. Kolona u riekuilibrua nën 10 mM KOH për 8.5 minuta.
Metabolitët e eluuar kombinohen me një rrjedhë shtesë izopropanoli 150μl/min pas kolonës dhe më pas drejtohen në një spektrometër mase me rezolucion të lartë që vepron në modalitetin e jonizimit negativ. MS po monitoron diapazonin e masës nga m/z 50 në 750 me një rezolucion prej 60,000. AGC është vendosur në 1×106, dhe koha maksimale e jonit mbahet në 100 ms. Burimi i ngrohur ESI u operua me një tension spërkatjeje prej 3.5 kV. Cilësimet e tjera të burimit jonik janë si më poshtë: temperatura kapilare 275°C; rrjedha e gazit të mbështjellësit, 60 AU; rrjedha e gazit ndihmës, 20 AU në 300°C, dhe vendosja e lentes S në 60 AU.
Analiza e të dhënave të metabolitëve të etiketuar me 13C. Përdorni programin TraceFinder (versioni 4.2, Thermo Fisher Scientific) për analizën e të dhënave të raportit të izotopeve. Identiteti i secilit përbërës u verifikua nga një përbërës referues i besueshëm dhe u analizua në mënyrë të pavarur. Për të kryer analizën e pasurimit të izotopeve, zona e kromatogramit jonik të nxjerrë (XIC) të secilit izotop 13C (Mn) u nxor nga [M + H]+, ku n është numri i karbonit të përbërësit të synuar, i përdorur për të analizuar aminoacidet ose [MH]+ përdoret për të analizuar anionet. Saktësia masive e XIC është më pak se pesë pjesë për milion, dhe saktësia e RT është 0.05 minuta. Analiza e pasurimit kryhet duke llogaritur raportin e secilit izotop të zbuluar me shumën e të gjithë izotopeve të përbërësit përkatës. Këto raporte jepen si vlera përqindjeje për secilin izotop, dhe rezultatet shprehen si përqindje molare e pasurimit (MPE), siç është përshkruar më parë (42).
Peleta e ngrirë e neuronit u homogjenizua në metanol 80% të ftohtë me akull (v/v), u vorteksua dhe u inkubua në -20°C për 30 minuta. Vorteksojeni përsëri mostrën dhe përziejeni në +4°C për 30 minuta. Mostra u centrifugua në 21,000 g për 5 minuta në 4°C, dhe më pas supernatanti që rezultoi u mblodh dhe u tha duke përdorur një koncentrator SpeedVac në 25°C për analiza të mëvonshme. Siç përshkruhet më sipër, analiza LC-MS u krye në aminoacidet e qelizave të renditura. Duke përdorur TraceFinder (versioni 4.2, Thermo Fisher Scientific), analiza e të dhënave u krye duke përdorur masën monoizotopike të secilit përbërës. Normalizimi kuantil i të dhënave të metabolitëve u krye duke përdorur paketën softuerike preprocessCore (57).
Përgatitja e prerjes. Miu u anestezua shpejt me dioksid karboni dhe iu dekapitua koka, truri u hoq shpejt nga kafka dhe thika vibruese e mbushur me akull (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Gjermani) u përdor për ta prerë atë në prerje sagitale prej 300 deri në 375 μm. Gazifikim me karbon të ftohtë (95% O2 dhe 5% CO2). Ca2 + ACSF i ulët (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM tampon fosfati natriumi, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukozë, 1.0 mM CaCl2 dhe 6.0 mM MgCl2. Rregullimi në pH 7.4 dhe 310 deri në 330 mOsm). Transferoni fetat e trurit të përftuara në një dhomë që përmban Ca2 + ACSF më të lartë (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM tampon fosfati natriumi, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukozë, 4.0 mM CaCl2 dhe mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 dhe 310 deri në 320 mOsm). Ruani fetat për 20 deri në 30 minuta në mënyrë që të mund të rikthehen para regjistrimit.
regjistrim. Për të gjitha regjistrimet u përdor një skenë mikroskopi e pajisur me një dhomë regjistrimi fikse dhe një lente objektivi me zhytje 20x në ujë (Scientifica). Qelizat e supozuara Purkinje u identifikuan nga (i) madhësia e trupit, (ii) vendndodhja anatomike e trurit të vogël dhe (iii) shprehja e gjenit raportues fluoreshent mtYFP. Pipeta me copëza me një rezistencë maje prej 5 deri në 11 megohm nxirret nga një kapilar qelqi borosilikat (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Gjermani) dhe një pipetë horizontale Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). Të gjitha regjistrimet u kryen nga amplifikatori i kapëses npi ELC-03XS (npi electronic GmbH, Tam, Gjermani), i cili kontrollohej nga softueri Signal (versioni 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). Eksperimenti u regjistrua me një shpejtësi mostrimi prej 12.5 kHz. Sinjali filtrohet me dy filtra Bessel me kalim të shkurtër me frekuenca prerëse prej 1.3 dhe 10 kHz përkatësisht. Kapaciteti i membranës dhe i pipetës kompensohet nga qarku i kompensimit duke përdorur amplifikatorin. Të gjitha eksperimentet u kryen nën kontrollin e një kamere Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Gjermani), e cila kontrollohej nga softueri Hokawo (versioni 2.8, Hamamatsu, Gerden, Gjermani).
Konfigurimi dhe analiza rutinë e të gjithë qelizës. Menjëherë para regjistrimit, mbushni pipetën me tretësirën e brendshme që përmban substancat e mëposhtme: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM glukonat kaliumi, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM trifosfat guanozine (GTP) (Na) dhe 10.0 mM fosfat kreatinine u rregulluan në pH 7.25, dhe presioni osmotik ishte 290 mOsm (saharozë). Menjëherë pas aplikimit të një force prej 0 pA për të çarë membranën, u mat potenciali i membranës në qetësi. Rezistenca hyrëse matet duke aplikuar rryma hiperpolarizuara prej -40, -30, -20 dhe -10 pA. Matni madhësinë e përgjigjes së tensionit dhe përdorni ligjin e Ohmit për të llogaritur rezistencën hyrëse. Aktiviteti spontan u regjistrua në një kapëse tensioni për 5 minuta, dhe sPSC u identifikua dhe u mat në Igor Pro (versioni 32 7.01, WaveMetrics, Liqeni Oswego, Oregon, SHBA) duke përdorur një skript njohjeje gjysmë-automatik. Kurba IV dhe rryma në gjendje të qëndrueshme maten duke e fiksuar baterinë në potenciale të ndryshme (duke filluar nga -110 mV) dhe duke rritur tensionin në hapa prej 5 mV. Prodhimi i AP u testua duke aplikuar një rrymë depolarizuese. Kapni qelizën në -70 mV ndërsa aplikoni një puls të rrymës depolarizuese. Rregulloni madhësinë e hapit të secilës njësi regjistrimi veçmas (10 deri në 60 pA). Llogaritni frekuencën maksimale të AP duke numëruar manualisht majat e pulsit që shkaktojnë frekuencën më të lartë të AP. Pragu i AP analizohet duke përdorur derivatin e dytë të pulsit të depolarizimit që së pari shkakton një ose më shumë AP.
Konfigurimi dhe analiza e njollave të shpuara. Kryeni regjistrimin e njollave të shpuara duke përdorur protokollet standarde. Përdorni një pipetë pa ATP dhe GTP që nuk përmban përbërësit e mëposhtëm: 128 mM glukonat K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA dhe 2 mM MgCl2, dhe rregullojeni në pH 7.2 (duke përdorur KOH). ATP dhe GTP lihen jashtë tretësirës intraqelizore për të parandaluar përshkueshmërinë e pakontrolluar të membranës qelizore. Pipeta e njollave mbushet me një tretësirë ​​të brendshme që përmban amfotericinë (afërsisht 200 deri në 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) për të marrë një regjistrim të njollave të shpuara. Amfotericina u tret në dimetil sulfoksid (përqendrimi përfundimtar: 0.1 deri në 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Përqendrimi i DMSO-së së përdorur nuk pati efekt të rëndësishëm në neuronet e studiuara. Gjatë procesit të shpimit, rezistenca e kanalit (Ra) u monitorua vazhdimisht dhe eksperimenti filloi pasi amplituda e Ra dhe AP u stabilizua (20-40 minuta). Aktiviteti spontan matet në një kapëse tensioni dhe/ose rryme për 2 deri në 5 minuta. Analiza e të dhënave u krye duke përdorur Igor Pro (versioni 7.05.2, WaveMetrics, SHBA), Excel (versioni 2010, Microsoft Corporation, Redmond, SHBA) dhe GraphPad Prism (versioni 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Shtetet e Bashkuara). Për të identifikuar AP-të spontane, përdoret shtesa NeuroMatic v3.0c e IgorPro. Identifikoni automatikisht AP-të duke përdorur një prag të caktuar, i cili rregullohet individualisht për secilin regjistrim. Duke përdorur intervalin e majës, përcaktoni frekuencën e majës me frekuencën maksimale të menjëhershme të majës dhe frekuencën mesatare të majës.
Izolimi i PN-së. Duke iu përshtatur protokollit të publikuar më parë, PN-të u pastruan nga truri i vogël i miut në një fazë të specifikuar (58). Shkurt, truri i vogël u disektua dhe u gri në një medium disociimi të ftohtë me akull [pa HBSS Ca2+ dhe Mg2+, të plotësuar me 20 mM glukozë, penicilinë (50 U/ml) dhe streptomicinë (0.05 mg/ml)], dhe më pas mediumi u tret në papainë [HBSS, i plotësuar me 1-cisteinë·HCl (1 mg/ml), papainë (16 U/ml) dhe deoksiribonukleazë I (DNase I; 0.1 mg/ml)]. Trajtoni për 30 minuta në 30°C. Së pari, lani indet në mjedisin HBSS që përmban mukus veze (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) dhe DNase (0.1 mg/ml) në temperaturë ambienti për të parandaluar tretjen enzimatike, dhe më pas në mjedisin HBSS që përmban 20 mM glukozë. Bluarja e butë në HBSS, penicilina (50 U/ml), streptomicina (0.05 mg/ml) dhe DNase (0.1 mg/ml) çliron qeliza të vetme. Suspensioni qelizor që rezultoi u filtrua përmes një sitë qelizash 70μm, më pas qelizat u peletizuan me centrifugim (1110 rpm, 5 minuta, 4°C) dhe u risuspenduan në mjedisin e klasifikimit [HBSS, i plotësuar me 20 mM glukozë, 20% serum fetal të gjedhit), penicilinë (50 U/ml) dhe streptomicinë (0.05 mg/ml)]; vlerësoni qëndrueshmërinë e qelizave me jodur propidiumi dhe rregulloni dendësinë e qelizave në 1×106 deri në 2×106 qeliza/ml. Përpara citometrisë me rrjedhë, pezullimi u filtrua përmes një sitë qelizash 50 μm.
Citometri me rrjedhje. Renditja e qelizave u krye në 4°C duke përdorur makinën FACSAria III (BD Biosciences) dhe softuerin FACSDiva (BD Biosciences, versioni 8.0.1). Suspensioni qelizor u rendit duke përdorur një grykë 100 μm nën një presion prej 20 psi me një shpejtësi prej ~2800 ngjarjesh/sek. Meqenëse kriteret tradicionale të hapjes (madhësia e qelizës, diskriminimi bimodal dhe karakteristikat e shpërndarjes) nuk mund të sigurojnë izolimin e saktë të PN nga llojet e tjera të qelizave, strategjia e hapjes vendoset bazuar në krahasimin e drejtpërdrejtë të intensitetit dhe autofluoreshencës së YFP në minjtë mitoYFP+ ​​​​dhe mitoYFP − kontroll. YFP ngacmohet duke rrezatuar mostrën me një linjë lazeri 488 nm, dhe sinjali zbulohet duke përdorur një filtër kalimi brezash 530/30 nm. Në minjtë mitoYFP+ ​​​​, forca relative e gjenit raportues Rosa26-mitoYFP përdoret gjithashtu për të dalluar fragmentet e trupit neuronal dhe aksonit. 7-AAD ngacmohet me një lazer të verdhë 561 nm dhe zbulohet me një filtër kalimi bande 675/20 nm për të përjashtuar qelizat e vdekura. Për të ndarë astrocitet në të njëjtën kohë, pezullimi qelizor u ngjyros me ACSA-2-APC, më pas mostra u rrezatua me një linjë lazeri 640 nm dhe një filtër kalimi bande 660/20 nm u përdor për të zbuluar sinjalin.
Qelizat e mbledhura u peletuan me anë të centrifugimit (1110 rpm, 5 minuta, 4°C) dhe u ruajtën në -80°C deri në përdorim. Minjtë Mfn2cKO dhe këlyshët e tyre të mbetur klasifikohen në të njëjtën ditë për të minimizuar ndryshueshmërinë procedurale. Prezantimi dhe analiza e të dhënave FACS u krye duke përdorur softuerin FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, SHBA).
Siç u përmend më sipër (59), PCR në kohë reale përdoret për të izoluar ADN-në nga neuronet e renditura për përcaktimin sasior të mëvonshëm të mtADN-së. Lineariteti dhe ndjeshmëria e pragut u testuan fillimisht duke kryer qPCR në numra të ndryshëm qelizash. Shkurt, mblidhni 300 PN në një tampon lize të përbërë nga 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 dhe proteinazë K (200 ng/ml) dhe inkuboni në 55°C për 120 minuta. Qelizat u inkubuan më tej në 95°C për 10 minuta për të siguruar inaktivizimin e plotë të proteinazës K. Duke përdorur një sondë TaqMan (Thermo Fisher) specifike për mt-Nd1, mtADN u mat me PCR gjysmë-sasiore në sistemin PCR në kohë reale 7900HT (Thermo Fisher Scientific). Science, numri i katalogut Mm04225274_s1), gjenet mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, numri i katalogut AIVI3E8) dhe gjenet 18S (Thermo Fisher Scientific, numri i katalogut Hs99999901_s1).
Përgatitja e mostrës së proteomës. Duke ngrohur tretësirën në 95°C për 10 minuta dhe duke e sonizuar me ultratinguj, në tamponin e lizës [6 M klorur guanidine, 10 mM tris(2-karboksietil) fosfinë hidroklorur, 10 mM kloroacetamid dhe 100 mM tris-Lyse të ngrira të granulave të neuroneve në HCl]. Në Bioruptor (Diagenode) për 10 minuta (30 sekonda puls / 30 sekonda periudhë pauze). Mostra u hollua 1:10 në 20 mM tris-HCl (pH 8.0), u përzie me 300 ng tripsinë ari (Promega) dhe u inkubua gjatë natës në 37°C për të arritur tretje të plotë. Në ditën e dytë, mostra u centrifugua në 20,000 g për 20 minuta. Supernatanti u hollua me 0.1% acid formik dhe tretësira u çkripëzua me StageTips të përgatitur vetë. Mostra u tha në një instrument SpeedVac (koncentrator Eppendorf plus 5305) në 45°C, dhe më pas peptidi u pezullua në acid formik 0.1%. Të gjitha mostrat u përgatitën njëkohësisht nga i njëjti person. Për të analizuar mostrat e astrociteve, 4 μg peptide të çkripura u etiketuan me një etiketë mase tandem (TMT10plex, numri i katalogut 90110, Thermo Fisher Scientific) me një raport peptidi ndaj reagentit TMT prej 1:20. Për etiketimin TMT, 0.8 mg reagenti TMT u risuspendua në 70 μl ACN anhidrik, dhe peptidi i tharë u rikonstituua në 9 μl 0.1 M TEAB (bikarbonat trietilamoniumi), të cilit iu shtuan 7 μl reagenti TMT në ACN. Përqendrimi ishte 43.75%. Pas 60 minutash inkubimi, reaksioni u shua me 2 μl hidroksilaminë 5%. Peptidet e etiketuara u mblodhën, u thanë, u risuspenduan në 200μl acid formik (FA) 0.1%, u ndanë në dy pjesë dhe më pas u çkriptuan duke përdorur StageTips të prodhuar vetë. Duke përdorur kromatografin e lëngshëm UltiMate 3000 me performancë ultra të lartë (kromatografi i lëngshëm UltiMate 3000 me performancë ultra të lartë), njëra nga dy gjysmat u fraksionua në një kolonë kromatografike Acquity 1mm x 150mm të mbushur me grimca C18 130Å1.7μm (Waters, katalogu nr. SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Ndani peptidet me një shpejtësi rrjedhjeje prej 30μl/min, ndani nga 1% në 50% tampon B për 85 minuta me një gradient hap pas hapi prej 96 minutash, nga 50% në 95% tampon B për 3 minuta, pastaj 8 minuta për 95% tampon B; Tamponi A është 5% ACN dhe 10 mM bikarbonat amoniumi (ABC), dhe tamponi B është 80% ACN dhe 10 mM ABC. Mblidhni fraksionet çdo 3 minuta dhe kombinojini ato në dy grupe (1 + 17, 2 + 18, etj.) dhe thajini ato në një centrifugë vakumi.
Analiza LC-MS/MS. Për spektrometrinë e masës, peptidet (numri r119.aq) u ndanë në një kolonë analitike PicoFrit me diametër të brendshëm 25 cm dhe 75 μm (lente objektivi e re, numri i pjesës PF7508250) të pajisur me medium ReproSil-Pur 120 C18-AQ 1.9 μm (Dr. Maisch, mat). Përdoret EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Gjermani). Kolona u mbajt në 50°C. Tamponët A dhe B janë përkatësisht 0.1% acid formik në ujë dhe 0.1% acid formik në 80% ACN. Peptidet u ndanë nga tamponi B 6% në 31% për 65 minuta dhe nga tamponi B 31% në 50% për 5 minuta me një gradient prej 200 nl/min. Peptidet e eluuara u analizuan në një spektrometër mase Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Matja m/z e prekursorit të peptidit kryhet me një rezolucion prej 120,000 në diapazonin prej 350 deri në 1500 m/z. Duke përdorur 27% energji të normalizuar të përplasjes, prekursori më i fortë me një gjendje ngarkese prej 2 deri në 6 zgjidhet për copëtimin e disociimit të kurthit C me energji të lartë (HCD). Koha e ciklit është vendosur në 1 s. Vlera m/z e fragmentit të peptidit u mat në kurthin jonik duke përdorur objektivin më të vogël AGC prej 5×104 dhe kohën maksimale të injektimit prej 86 ms. Pas fragmentimit, prekursori u vendos në listën dinamike të përjashtimit për 45 s. Peptidet e shënuara me TMT u ndanë në një kolonë Acclaim PepMap 50 cm, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, numri i katalogut 164942), dhe spektrat e migrimit u analizuan në një spektrometër masiv Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) të pajisur me pajisje të joneve asimetrike të valës me fushë të lartë (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) që funksionon në dy tensione kompensimi prej −50 dhe −70 V. MS3 i përzgjedhur bazuar në pararendësin e sinkronizimit përdoret për matjen e sinjalit jonik të raportit TMT. Ndarja e peptideve u krye në EASY-nLC 1200, duke përdorur një elucion gradient linear 90%, me një përqendrim tamponi prej 6% deri në 31%; tamponi A ishte 0.1% FA, dhe tamponi B ishte 0.1% FA dhe 80% ACN. Kolona analitike funksionon në 50°C. Përdorni FreeStyle (versioni 1.6, Thermo Fisher Scientific) për të ndarë skedarin origjinal sipas tensionit të kompensimit FAIMS.
Identifikimi dhe përcaktimi sasior i proteinave. Duke përdorur motorin e kërkimit të integruar Andromeda, të dhënat origjinale u analizuan duke përdorur MaxQuant versionin 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Përveç sekuencave të rekombinazës Cre dhe YFP të marra nga Aequorea victoria, spektrat e fragmenteve të peptideve u kërkuan për sekuencën kanonike dhe sekuencën izoforme të proteomës referuese të miut (ID e Proteomit UP000000589, shkarkuar nga UniProt në maj 2017). Oksidimi i metioninës dhe acetilimi N-terminal i proteinave u vendosën si modifikime të ndryshueshme; metilimi i cisteinës karbamoil u vendos si modifikime fikse. Parametrat e tretjes janë vendosur në "specifikitet" dhe "tripsinë/P". Numri minimal i peptideve dhe peptideve të rrojës të përdorura për identifikimin e proteinave është 1; numri minimal i peptideve unike është 0. Në kushtet e përputhjes së hartës së peptideve, shkalla e identifikimit të proteinave ishte 0.01. Opsioni "Peptidi i Dytë" është aktivizuar. Përdorni opsionin "përputhje midis ekzekutimeve" për të transferuar identifikime të suksesshme midis skedarëve të ndryshëm origjinalë. Përdorni raportin minimal të LFQ me numërimin 1 për kuantifikimin pa etiketë (LFQ) (60). Intensiteti i LFQ filtrohet për të paktën dy vlera të vlefshme në të paktën një grup gjenotipi në secilën pikë kohore dhe ekstrapolohet nga një shpërndarje normale me një gjerësi prej 0.3 dhe lëviz poshtë 1.8. Përdorni platformën kompjuterike Perseus (https://maxquant.net/perseus/) dhe R (https://r-project.org/) për të analizuar rezultatet e LFQ. Një test t i moderuar dypalësh nga paketa softuerike limma u përdor për analizën e shprehjes diferenciale (61). Analiza e të dhënave eksploruese kryhet duke përdorur ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally dhe pheatmap. Të dhënat e proteomikës të bazuara në TMT u analizuan duke përdorur versionin 1.6.10.43 të MaxQuant. Kërkoni të dhëna të papërpunuara të proteomikës nga baza e të dhënave të proteomikës njerëzore të UniProt, e cila u shkarkua në shtator 2018. Analiza përfshin faktorin e korrigjimit të pastërtisë së izotopit të ofruar nga prodhuesi. Përdorni limma në R për analizën e shprehjes diferenciale. Të dhënat origjinale, rezultatet e kërkimit në bazën e të dhënave dhe rrjedha e punës dhe rezultatet e analizës së të dhënave ruhen të gjitha në aleancën ProteomeXchange përmes depozitës së partnerëve PRIDE me identifikuesin e të dhënave PXD019690.
Shënimet funksionale pasurojnë analizën. Mjeti Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) u përdor për të përcaktuar pasurinë e termave të shënimeve funksionale të të dhënave në 8 javë (Figura 1). Shkurt, lista sasiore e proteinave e marrë nga analiza e të dhënave LC-MS/MS (spektrometria e masës tandem) përdoret me kriteret e mëposhtme të filtrit: Mus musculus zgjidhet si specie dhe sfond, dhe kategoria tregon vlerën P të rregulluar nga Benjamini për pasurim 0.05 ose më të ulët që konsiderohet e rëndësishme. Për këtë grafik, tregohen pesë kategoritë kryesore të tepërta në secilin grumbull bazuar në vlerën e rregulluar të P. Duke përdorur testin t të shumëfishtë, duke përdorur programin linear të rritjes me dy faza të Benjamini, Krieger dhe Yekutieli (Q = 5%), analiza e shprehjes së proteinave me rrjedhën kohore kryhet në kandidatët e rëndësishëm të identifikuar në secilën kategori, dhe çdo rresht analizohet veçmas. Nuk ka nevojë të miratohet një SD konsistente.
Për të krahasuar rezultatet e këtij studimi me bazat e të dhënave të publikuara dhe për të gjeneruar një diagram Venn në Figurën 1, ne e kombinuam listën sasiore të proteinave me shënimet e MitoCarta 2.0 (24). Përdorni mjetin online Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) për të gjeneruar diagramin.
Për informacion të detajuar mbi procedurat statistikore të përdorura për analizën proteomike, ju lutemi referojuni seksionit përkatës të Materialeve dhe Metodave. Për të gjitha eksperimentet e tjera, informacion i detajuar mund të gjendet në legjendën përkatëse. Nëse nuk specifikohet ndryshe, të gjitha të dhënat shprehen si mesatare ± SEM, dhe të gjitha analizat statistikore u kryen duke përdorur softuerin GraphPad Prism 8.1.2.
Për materiale shtesë për këtë artikull, ju lutemi shihni http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Ky është një artikull me akses të hapur i shpërndarë sipas kushteve të Licencës Creative Commons Attribution-Jo-Commercial, e cila lejon përdorimin, shpërndarjen dhe riprodhimin në çdo medium, për sa kohë që përdorimi përfundimtar nuk është për përfitim komercial dhe kushti kryesor është që vepra origjinale të jetë e saktë. Referencë.
Shënim: Ne ju kërkojmë vetëm të jepni adresën tuaj të email-it në mënyrë që personi që ju rekomandoni në faqe të dijë se ju dëshironi që ai ta shohë email-in dhe se nuk është spam. Ne nuk do të kapim asnjë adresë email-i.
Kjo pyetje përdoret për të testuar nëse jeni vizitor dhe për të parandaluar dërgimin automatik të spam-it.
Nga E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Analiza proteomike e neuroneve jofunksionale zbuloi se programet metabolike aktivizohen për të luftuar neurodegjenerimin.
Nga E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Analiza proteomike e neuroneve jofunksionale zbuloi se programet metabolike aktivizohen për të luftuar neurodegjenerimin.
©2020 Shoqata Amerikane për Avancimin e Shkencës. të gjitha të drejtat e rezervuara. AAAS është partner i HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dhe COUNTER. Shkenca përparon ISSN 2375-2548.