Artikulli është pjesë e temës kërkimore “Teknologjitë e avancuara të bioremediacionit dhe proceset e riciklimit të përbërjeve organike sintetike (SOC)”. Shih të gjitha 14 artikujt
Hidrokarburet aromatike policiklike (PAH) me peshë të ulët molekulare, të tilla si naftalina dhe naftalenet e zëvendësuara (metilnaftalina, acidi naftoik, 1-naftil-N-metilkarbamati, etj.), përdoren gjerësisht në industri të ndryshme dhe janë gjenotoksike, mutagjene dhe/ose kancerogjene për organizmat. Këto komponime organike sintetike (SOC) ose ksenobiotikë konsiderohen ndotës prioritarë dhe përbëjnë një kërcënim serioz për mjedisin global dhe shëndetin publik. Intensiteti i aktiviteteve njerëzore (p.sh. gazifikimi i qymyrit, rafinimi i naftës, emetimet e automjeteve dhe aplikimet bujqësore) përcakton përqendrimin, fatin dhe transportin e këtyre komponimeve të kudondodhura dhe të vazhdueshme. Përveç metodave të trajtimit/largimit fizik dhe kimik, teknologjitë e gjelbra dhe miqësore me mjedisin, të tilla si bioremediation, të cilat përdorin mikroorganizma të aftë për të degraduar plotësisht POC-të ose për t'i shndërruar ato në nënprodukte jo-toksike, janë shfaqur si një alternativë e sigurt, me kosto efektive dhe premtuese. Specie të ndryshme bakteriale që i përkasin tipave Proteobacteria (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia dhe Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus dhe Paenibacillus) dhe Actinobacteria (Rhodococcus dhe Arthrobacter) në mikrobiotën e tokës kanë demonstruar aftësinë për të degraduar komponime të ndryshme organike. Studimet metabolike, gjenomika dhe analiza metagenomike na ndihmojnë të kuptojmë kompleksitetin katabolik dhe diversitetin e pranishëm në këto forma të thjeshta të jetës, të cilat mund të aplikohen më tej për biodegradim efikas. Ekzistenca afatgjatë e PAH-ve ka rezultuar në shfaqjen e fenotipeve të reja të degradimit përmes transferimit horizontal të gjeneve duke përdorur elementë gjenetikë si plazmidet, transpozonet, bakteriofagët, ishujt gjenomikë dhe elementët integrues konjugativë. Biologjia e sistemeve dhe inxhinieria gjenetike e izolateve specifike ose komuniteteve model (konsorciumeve) mund të mundësojnë bioremediacion gjithëpërfshirës, ​​të shpejtë dhe efikas të këtyre PAH-ve përmes efekteve sinergjike. Në këtë përmbledhje, ne përqendrohemi në rrugët dhe diversitetin e ndryshëm metabolik, përbërjen dhe diversitetin gjenetik, si dhe përgjigjet/përshtatjet qelizore të naftalenit dhe baktereve që zbërthejnë naftalenin e zëvendësuar. Kjo do të ofrojë informacion ekologjik për aplikimin në terren dhe optimizimin e shtamit për bioremediacion efikas.
Zhvillimi i shpejtë i industrive (petrokimikatet, bujqësia, farmaceutika, ngjyrat e tekstilit, kozmetika, etj.) ka kontribuar në prosperitetin ekonomik global dhe përmirësimin e standardeve të jetesës. Ky zhvillim eksponencial ka rezultuar në prodhimin e një numri të madh të përbërjeve organike sintetike (SOC), të cilat përdoren për të prodhuar produkte të ndryshme. Këto përbërje të huaja ose SOC përfshijnë hidrokarbure aromatike policiklike (PAH), pesticide, herbicide, plastifikues, ngjyra, farmaceutikë, organofosfate, retardantë flakësh, tretës organikë të paqëndrueshëm, etj. Ato emetohen në atmosferë, ekosisteme ujore dhe tokësore ku kanë ndikime shumëdimensionale, duke shkaktuar efekte të dëmshme në bioforma të ndryshme përmes ndryshimit të vetive fiziko-kimike dhe strukturës së komunitetit (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Shumë ndotës aromatikë kanë ndikime të forta dhe shkatërruese në shumë ekosisteme/pika të nxehta të biodiversitetit të paprekur (p.sh., shkëmbinjtë koralorë, shtresat e akullit Arktik/Antarktik, liqenet e maleve të larta, sedimente të detit të thellë, etj.) (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). Studimet e fundit gjeomikrobiologjike kanë treguar se depozitimi i lëndës organike sintetike (p.sh., ndotësit aromatikë) dhe derivateve të tyre në sipërfaqet e strukturave artificiale (mjedisi i ndërtuar) (p.sh., vendet e trashëgimisë kulturore dhe monumentet e bëra prej graniti, guri, druri dhe metali) përshpejton degradimin e tyre (Gadd 2017; Liu et al. 2018). Aktivitetet njerëzore mund të intensifikojnë dhe përkeqësojnë degradimin biologjik të monumenteve dhe ndërtesave përmes ndotjes së ajrit dhe ndryshimeve klimatike (Liu et al. 2020). Këta ndotës organikë reagojnë me avujt e ujit në atmosferë dhe vendosen në strukturë, duke shkaktuar degradim fizik dhe kimik të materialit. Biodegradimi njihet gjerësisht si ndryshime të padëshirueshme në pamjen dhe vetitë e materialeve të shkaktuara nga organizmat e gjallë që ndikojnë në ruajtjen e tyre (Pochon dhe Jaton, 1967). Veprimi i mëtejshëm mikrobik (metabolizmi) i këtyre komponimeve mund të zvogëlojë integritetin strukturor, efektivitetin e ruajtjes dhe vlerën kulturore (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). Nga ana tjetër, në disa raste, përshtatja dhe reagimi mikrobik ndaj këtyre strukturave është gjetur të jetë i dobishëm pasi ato formojnë biofilma dhe kore të tjera mbrojtëse që zvogëlojnë shkallën e prishjes/dekompozimit (Martino, 2016). Prandaj, zhvillimi i strategjive efektive afatgjata të ruajtjes së qëndrueshme për monumentet prej guri, metali dhe druri kërkon një kuptim të plotë të proceseve kryesore të përfshira në këtë proces. Krahasuar me proceset natyrore (proceset gjeologjike, zjarret në pyje, shpërthimet vullkanike, reaksionet bimore dhe bakteriale), aktivitetet njerëzore rezultojnë në çlirimin e vëllimeve të mëdha të hidrokarbureve aromatike policiklike (PAH) dhe karbonit tjetër organik (OC) në ekosisteme. Shumë PAH të përdorura në bujqësi (insekticide dhe pesticide si DDT, atrazinë, karbaril, pentaklorofenol, etj.), industri (nafta bruto, llum/mbetje nafte, plastika të derivuara nga nafta, PCB, plastifikues, detergjentë, dezinfektantë, tymosës, aroma dhe konservues), produkte kujdesi personal (kremra dielli, dezinfektantë, repelentë insektesh dhe myshqe policikike) dhe municione (eksplozivë si 2,4,6-TNT) janë ksenobiotikë potencialë që mund të ndikojnë në shëndetin planetar (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna dhe Phale, 2008; Petrie et al., 2015). Kjo listë mund të zgjerohet për të përfshirë komponime të derivuara nga nafta (vajra karburanti, lubrifikantë, asfaltene), bioplastika me peshë të lartë molekulare dhe lëngje jonike (Amde et al., 2015). Tabela 1 rendit ndotës të ndryshëm aromatikë dhe zbatimet e tyre në industri të ndryshme. Në vitet e fundit, emetimet antropogjene të përbërjeve organike të paqëndrueshme, si dhe dioksidit të karbonit dhe gazrave të tjerë serrë, kanë filluar të rriten (Dvorak et al., 2017). Megjithatë, ndikimet antropogjene i tejkalojnë ndjeshëm ato natyrore. Përveç kësaj, ne zbuluam se një numër i SOC-ve vazhdojnë në shumë mjedise mjedisore dhe janë identifikuar si ndotës të rinj me efekte negative në bioma (Figura 1). Agjencitë mjedisore si Agjencia e Mbrojtjes së Mjedisit e Shteteve të Bashkuara (USEPA) kanë përfshirë shumë nga këta ndotës në listën e tyre të prioriteteve për shkak të vetive të tyre citotoksike, gjenotoksike, mutagjene dhe kancerogjene. Prandaj, nevojiten rregullore të rrepta për asgjësimin dhe strategji efektive për trajtimin/largimin e mbeturinave nga ekosistemet e kontaminuara. Metoda të ndryshme të trajtimit fizik dhe kimik, të tilla si piroliza, trajtimi termik oksidativ, ajrosja e ajrit, deponia, djegia, etj., janë joefektive dhe të kushtueshme dhe gjenerojnë nënprodukte gërryese, toksike dhe të vështira për t'u trajtuar. Me rritjen e ndërgjegjësimit global për mjedisin, mikroorganizmat e aftë për të degraduar këta ndotës dhe derivatet e tyre (siç janë halogjenuar, nitro, alkil dhe/ose metil) po tërheqin vëmendje gjithnjë e më të madhe (Fennell et al., 2004; Haritash dhe Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). Përdorimi i këtyre mikroorganizmave vendas kandidatë vetëm ose në kultura të përziera (koloni) për heqjen e ndotësve aromatikë ka përparësi në aspektin e sigurisë mjedisore, kostos, efikasitetit, efektivitetit dhe qëndrueshmërisë. Studiuesit po eksplorojnë gjithashtu integrimin e proceseve mikrobike me metodat elektrokimike redoks, përkatësisht sistemet bioelektrokimike (BES), si një teknologji premtuese për trajtimin/heqjen e ndotësve (Huang et al., 2011). Teknologjia BES ka tërhequr vëmendje gjithnjë e më të madhe për shkak të efikasitetit të saj të lartë, kostos së ulët, sigurisë mjedisore, funksionimit në temperaturë ambienti, materialeve biokompatibile dhe aftësisë për të rikuperuar nënprodukte të vlefshme (p.sh., energji elektrike, karburant dhe kimikate) (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). Ardhja e mjeteve/metodave të sekuencimit të gjenomit me rendiment të lartë dhe omikës ka ofruar një mori informacionesh të reja mbi rregullimin gjenetik, proteomikën dhe fluksomikën e reaksioneve të mikroorganizmave të ndryshëm degradues. Kombinimi i këtyre mjeteve me biologjinë e sistemeve ka rritur më tej kuptimin tonë të përzgjedhjes dhe rregullimit të imët të shtigjeve katabolike të synuara në mikroorganizma (domethënë, dizajnin metabolik) për të arritur biodegradim efikas dhe efektiv. Për të hartuar strategji efektive të bioremediacionit duke përdorur mikroorganizma kandidatë të përshtatshëm, duhet të kuptojmë potencialin biokimik, diversitetin metabolik, përbërjen gjenetike dhe ekologjinë (autoekologjinë/sinekologjinë) e mikroorganizmave.
Fig. 1. Burimet dhe rrugët e përhapjes së PAH-ve me peshë të ulët molekulare përmes mjediseve të ndryshme mjedisore dhe faktorëve të ndryshëm që ndikojnë në biota. Vijat e ndërprera përfaqësojnë ndërveprimet midis elementëve të ekosistemit.
Në këtë përmbledhje, ne jemi përpjekur të përmbledhim të dhënat mbi degradimin e PAH-ve të thjeshta si naftalina dhe naftalenet e zëvendësuara nga izolate të ndryshme bakteriale që mbulojnë rrugët metabolike dhe diversitetin, enzimat e përfshira në degradim, përbërjen/përmbajtjen dhe diversitetin e gjeneve, përgjigjet qelizore dhe aspekte të ndryshme të bioremediation-it. Kuptimi i niveleve biokimike dhe molekulare do të ndihmojë në identifikimin e llojeve të përshtatshme pritëse dhe inxhinierinë e tyre të mëtejshme gjenetike për bioremediation efektiv të ndotësve të tillë prioritarë. Kjo do të ndihmojë në zhvillimin e strategjive për krijimin e konsorciumeve bakteriale specifike për vendin për bioremediation efektiv.
Prania e një numri të madh të komponimeve aromatike toksike dhe të rrezikshme (që përmbushin rregullin e Huckel-it 4n + 2π elektrone, n = 1, 2, 3, …) përbën një kërcënim serioz për media të ndryshme mjedisore si ajri, toka, sedimentet dhe ujërat sipërfaqësore dhe nëntokësore (Puglisi et al., 2007). Këto komponime kanë unaza të vetme benzeni (monociklike) ose unaza të shumëfishta benzeni (policiklike) të rregulluara në formë lineare, këndore ose grumbullore dhe shfaqin stabilitet (stabilitet/jostabilitet) në mjedis për shkak të energjisë së lartë rezonante negative dhe inercisë (inertitet), e cila mund të shpjegohet nga hidrofobiciteti dhe gjendja e tyre e reduktuar. Kur unaza aromatike zëvendësohet më tej nga grupet metil (-CH3), karboksil (-COOH), hidroksil (-OH) ose sulfonat (-HSO3), ajo bëhet më e qëndrueshme, ka një afinitet më të fortë për makromolekulat dhe është bioakumulative në sistemet biologjike (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Disa hidrokarbure aromatike policiklike me peshë të ulët molekulare (LMWAH), siç është naftalina dhe derivatet e saj [metilnaftalini, acidi naftoik, naftalensulfonati dhe 1-naftil N-metilkarbamati (karbaril)], janë përfshirë në listën e ndotësve organikë prioritarë nga Agjencia Amerikane e Mbrojtjes së Mjedisit si gjenotoksikë, mutagjenë dhe/ose kancerogjenë (Cerniglia, 1984). Lëshimi i kësaj klase të NM-PAH-ve në mjedis mund të rezultojë në bioakumulimin e këtyre komponimeve në të gjitha nivelet e zinxhirit ushqimor, duke ndikuar kështu në shëndetin e ekosistemeve (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
Burimet dhe rrugët e PAH-ve në biota janë kryesisht përmes migrimit dhe ndërveprimeve midis komponentëve të ndryshëm të ekosistemit, siç janë toka, ujërat nëntokësore, ujërat sipërfaqësore, të korrat dhe atmosfera (Arey dhe Atkinson, 2003). Figura 1 tregon ndërveprimet dhe shpërndarjen e PAH-ve të ndryshme me peshë të ulët molekulare në ekosisteme dhe rrugët e tyre drejt biotës/ekspozimit njerëzor. PAH-të depozitohen në sipërfaqe si rezultat i ndotjes së ajrit dhe përmes migrimit (lëvizjes) së emetimeve të automjeteve, gazrave të shkarkimit industrial (gazifikimi i qymyrit, djegia dhe prodhimi i koksit) dhe depozitimit të tyre. Aktivitetet industriale, të tilla si prodhimi i tekstileve sintetike, ngjyrave dhe bojërave; ruajtja e drurit; përpunimi i gomës; aktivitetet e prodhimit të çimentos; prodhimi i pesticideve; dhe aplikimet bujqësore janë burime kryesore të PAH-ve në sistemet tokësore dhe ujore (Bamforth dhe Singleton, 2005; Wick et al., 2011). Studimet kanë treguar se tokat në zonat periferike dhe urbane, pranë autostradave dhe në qytetet e mëdha janë më të ndjeshme ndaj hidrokarbureve aromatike policiklike (PAH) për shkak të emetimeve nga termocentralet, ngrohja e banesave, ngarkesat e trafikut ajror dhe rrugor, si dhe aktivitetet e ndërtimit (Suman et al., 2016). (2008) treguan se PAH-të në tokë pranë rrugëve në New Orleans, Luiziana, SHBA ishin deri në 7189 μg/kg, ndërsa në hapësirë ​​të hapur, ato ishin vetëm 2404 μg/kg. Në mënyrë të ngjashme, nivele të PAH-ve deri në 300 μg/kg janë raportuar në zonat pranë vendeve të gazifikimit të qymyrit në disa qytete të SHBA-së (Kanaly dhe Harayama, 2000; Bamforth dhe Singleton, 2005). Tokat nga qytete të ndryshme indiane si Delhi (Sharma et al., 2008), Agra (Dubey et al., 2014), Mumbai (Kulkarni dhe Venkataraman, 2000) dhe Visakhapatnam (Kulkarni et al., 2014) janë raportuar të përmbajnë përqendrime të larta të PAH-ve. Komponimet aromatike adsorbohen më lehtë në grimcat e tokës, lëndën organike dhe mineralet argjilore, duke u bërë kështu mbledhës të mëdhenj të karbonit në ekosisteme (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). Burimet kryesore të PAH-ve në ekosistemet ujore janë reshjet (reshjet e lagështa/të thata dhe avujt e ujit), rrjedhjet urbane, shkarkimet e ujërave të zeza, rimbushja e ujërave nëntokësore etj. (Srogi, 2007). Është vlerësuar se rreth 80% e PAH-ve në ekosistemet detare rrjedhin nga reshjet, sedimentimi dhe shkarkimi i mbeturinave (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). Përqendrimet më të larta të PAH-ve në ujërat sipërfaqësore ose në rrjedhjet nga vendet e asgjësimit të mbeturinave të ngurta përfundimisht rrjedhin në ujërat nëntokësore, duke paraqitur një kërcënim të madh për shëndetin publik, pasi më shumë se 70% e popullsisë në Azinë Jugore dhe Juglindore pi ujëra nëntokësore (Duttagupta et al., 2019). Një studim i kohëve të fundit nga Duttagupta et al. (2020) mbi analizat e lumenjve (32) dhe ujërave nëntokësore (235) nga Bengali Perëndimor, Indi, zbuloi se rreth 53% e banorëve urbanë dhe 44% e banorëve ruralë (gjithsej 20 milionë banorë) mund të jenë të ekspozuar ndaj naftalenit (4.9–10.6 μg/L) dhe derivateve të tij. Modelet e ndryshme të përdorimit të tokës dhe rritja e nxjerrjes së ujërave nëntokësore konsiderohen të jenë faktorët kryesorë që kontrollojnë transportin vertikal (adveksionin) e PAH-ve me peshë të ulët molekulare në nëntokë. Rrjedhjet bujqësore, shkarkimet e ujërave të ndotura komunale dhe industriale, si dhe shkarkimet e mbeturinave të ngurta/mbeturinave janë gjetur të preken nga PAH-të në pellgjet e lumenjve dhe sedimentet nëntokësore. Reshjet atmosferike përkeqësojnë më tej ndotjen nga PAH-të. Përqendrime të larta të PAH-ve dhe derivateve të tyre alkil (gjithsej 51) janë raportuar në lumenj/pellgje ujëmbledhës në të gjithë botën, siç janë Lumi Fraser, Lumi Louan, Lumi Denso, Lumi Missouri, Lumi Anacostia, Lumi Ebro dhe Lumi Delaware (Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). Në sedimentet e pellgut të Lumit Ganges, naftaleni dhe fenantreni u gjetën të jenë më të rëndësishmet (të zbuluara në 70% të mostrave) (Duttagupta et al., 2019). Për më tepër, studimet kanë treguar se klorinimi i ujit të pijshëm mund të çojë në formimin e PAH-ve më toksike të oksigjenuara dhe të klorinuara (Manoli dhe Samara, 1999). PAH-të grumbullohen në drithëra, fruta dhe perime si rezultat i thithjes nga bimët nga tokat e kontaminuara, ujërat nëntokësore dhe reshjet (Fismes et al., 2002). Shumë organizma ujorë si peshqit, midhjet, molusqet dhe karkalecat janë të kontaminuar me PAH përmes konsumit të ushqimit të kontaminuar dhe ujit të detit, si dhe përmes indeve dhe lëkurës (Mackay dhe Fraser, 2000). Metodat e gatimit/përpunimit si pjekja në skarë, pjekja, tymosja, skuqja, tharja, pjekja dhe gatimi me qymyr druri gjithashtu mund të çojnë në sasi të konsiderueshme të PAH-ve në ushqim. Kjo varet kryesisht nga zgjedhja e materialit të tymosjes, përmbajtja e hidrokarbureve fenolike/aromatike, procedura e gatimit, lloji i ngrohësit, përmbajtja e lagështisë, furnizimi me oksigjen dhe temperatura e djegies (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). Hidrokarburet aromatike policiklike (PAH) janë zbuluar gjithashtu në qumësht në përqendrime të ndryshme (0.75–2.1 mg/L) (Girelli et al., 2014). Akumulimi i këtyre PAH-ve në ushqim varet gjithashtu nga vetitë fiziko-kimike të ushqimit, ndërsa efektet e tyre toksike lidhen me funksionet fiziologjike, aktivitetin metabolik, thithjen, shpërndarjen dhe shpërndarjen në trup (Mechini et al., 2011).
Toksiciteti dhe efektet e dëmshme të hidrokarbureve aromatike policiklike (PAH) janë të njohura prej kohësh (Cherniglia, 1984). Hidrokarburet aromatike policiklike me peshë të ulët molekulare (LMW-PAH) (dy deri në tre unaza) mund të lidhen në mënyrë kovalente me makromolekula të ndryshme si ADN-ja, ARN-ja dhe proteinat dhe janë kancerogjene (Santarelli et al., 2008). Për shkak të natyrës së tyre hidrofobike, ato ndahen nga membranat lipidike. Tek njerëzit, monooksigjenazat e citokromit P450 oksidojnë PAH-të në epokside, disa prej të cilave janë shumë reaktive (p.sh., epoksidi i baediolit) dhe mund të çojnë në transformimin e qelizave normale në ato malinje (Marston et al., 2001). Përveç kësaj, produktet e transformimit të PAH-ve si kinonet, fenolet, epoksidet, diolet, etj., janë më toksike se komponimet mëmë. Disa PAH dhe ndërmjetësit e tyre metabolikë mund të ndikojnë në hormonet dhe enzimat e ndryshme në metabolizëm, duke ndikuar kështu negativisht në rritjen, sistemin nervor qendror, sistemin riprodhues dhe imunitar (Swetha dhe Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008). Ekspozimi afatshkurtër ndaj PAH-ve me peshë të ulët molekulare është raportuar të shkaktojë funksion të dëmtuar të mushkërive dhe trombozë tek astmatikët dhe të rrisë rrezikun e kancerit të lëkurës, mushkërive, fshikëzës dhe traktit gastrointestinal (Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011). Studimet në kafshë kanë treguar gjithashtu se ekspozimi ndaj PAH-ve mund të ketë efekte negative në funksionin dhe zhvillimin riprodhues dhe mund të shkaktojë katarakte, dëmtime të veshkave dhe mëlçisë, si dhe verdhëz. Produkte të ndryshme të biotransformimit të PAH-ve, të tilla si diolet, epoksidet, kinonet dhe radikalet e lira (kationet), janë treguar se formojnë adukte të ADN-së. Është treguar se aduktet e qëndrueshme ndryshojnë mekanizmin e replikimit të ADN-së, ndërsa aduktet e paqëndrueshme mund ta depurinojnë ADN-në (kryesisht në adeninë dhe ndonjëherë në guaninë); të dyja mund të gjenerojnë gabime që çojnë në mutacione (Schweigert et al. 2001). Përveç kësaj, kinonet (benzo-/pan-) mund të gjenerojnë specie reaktive të oksigjenit (ROS), duke shkaktuar dëme fatale në ADN dhe makromolekula të tjera, duke ndikuar kështu në funksionin/qëndrueshmërinë e indeve (Ewa dhe Danuta 2017). Ekspozimi kronik ndaj përqendrimeve të ulëta të pirenit, bifenilit dhe naftalenit është raportuar të shkaktojë kancer te kafshët eksperimentale (Diggs et al. 2012). Për shkak të toksicitetit të tyre vdekjeprurës, pastrimi/largimi i këtyre PAH-ve nga vendet e prekura/të kontaminuara është një përparësi.
Metoda të ndryshme fizike dhe kimike janë përdorur për të hequr PAH-të nga vendet/mjediset e kontaminuara. Procese të tilla si djegia, deklorinimi, oksidimi UV, fiksimi dhe nxjerrja me tretës kanë shumë disavantazhe, duke përfshirë formimin e nënprodukteve toksike, kompleksitetin e procesit, çështjet e sigurisë dhe rregullatore, efikasitetin e ulët dhe koston e lartë. Megjithatë, biodegradimi mikrobik (i quajtur bioremediation) është një qasje alternative premtuese që përfshin përdorimin e mikroorganizmave në formën e kulturave ose kolonive të pastra. Krahasuar me metodat fizike dhe kimike, ky proces është miqësor me mjedisin, jo-invaziv, me kosto efektive dhe i qëndrueshëm. Bioremediation mund të kryhet në vendin e prekur (in situ) ose në një vend të përgatitur posaçërisht (ex situ) dhe për këtë arsye konsiderohet një metodë më e qëndrueshme remediation sesa metodat tradicionale fizike dhe kimike (Juhasz dhe Naidu, 2000; Andreoni dhe Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
Të kuptuarit e hapave metabolikë mikrobikë të përfshirë në degradimin e ndotësve aromatikë ka implikime të mëdha shkencore dhe ekonomike për qëndrueshmërinë ekologjike dhe mjedisore. Rreth 2.1×1018 gramë karbon (C) ruhen në sedimente dhe komponime organike (domethënë, naftë, gaz natyror dhe qymyr, pra, lëndë djegëse fosile) në të gjithë botën, duke dhënë një kontribut të rëndësishëm në ciklin global të karbonit. Megjithatë, industrializimi i shpejtë, nxjerrja e lëndëve djegëse fosile dhe aktivitetet njerëzore po i shterojnë këto rezervuarë karboni litosferik, duke lëshuar rreth 5.5×1015 g karbon organik (si ndotës) në atmosferë çdo vit (Gonzalez-Gaya et al., 2019). Pjesa më e madhe e këtij karboni organik hyn në ekosistemet tokësore dhe detare përmes sedimentimit, transportit dhe rrjedhjes. Përveç kësaj, ndotësit e rinj sintetikë që rrjedhin nga lëndët djegëse fosile, të tilla si plastika, plastifikuesit dhe stabilizuesit plastikë (ftalatet dhe izomerët e tyre), ndotin seriozisht ekosistemet detare, tokësore dhe ujore dhe biotën e tyre, duke përkeqësuar kështu rreziqet globale klimatike. Lloje të ndryshme të mikroplastikës, nanoplastikës, fragmenteve plastike dhe produkteve të tyre toksike monomere të nxjerra nga polietileni tereftalati (PET) janë grumbulluar në Oqeanin Paqësor midis Amerikës së Veriut dhe Azisë Juglindore, duke formuar "Gropën e Madhe të Mbeturinave të Paqësorit", duke dëmtuar jetën detare (Newell et al., 2020). Studimet shkencore kanë vërtetuar se nuk është e mundur të hiqen ndotës/mbeturina të tilla me anë të ndonjë metode fizike ose kimike. Në këtë kontekst, mikroorganizmat më të dobishëm janë ata të aftë të metabolizojnë ndotësit në mënyrë oksidative në dioksid karboni, energji kimike dhe nënprodukte të tjera jo-toksike që përfundimisht hyjnë në procese të tjera të ciklit të lëndëve ushqyese (H, O, N, S, P, Fe, etj.). Kështu, të kuptuarit e ekofiziologjisë mikrobike të mineralizimit të ndotësve aromatikë dhe kontrollit të tij mjedisor është thelbësore për vlerësimin e ciklit mikrobik të karbonit, buxhetit neto të karbonit dhe rreziqeve të ardhshme klimatike. Duke pasur parasysh nevojën urgjente për të hequr komponime të tilla nga mjedisi, kanë dalë në pah eko-industri të ndryshme të përqendruara në teknologjitë e pastra. Nga ana tjetër, vëlerësimi i mbetjeve industriale/kimikateve të mbetjeve të akumuluara në ekosisteme (domethënë, qasja nga mbetjet në pasuri) konsiderohet si një nga shtyllat e ekonomisë rrethore dhe objektivave të zhvillimit të qëndrueshëm (Close et al., 2012). Prandaj, të kuptuarit e aspekteve metabolike, enzimatike dhe gjenetike të këtyre kandidatëve potencialë për degradim është me rëndësi të madhe për largimin efektiv dhe bioremediacionin e ndotësve të tillë aromatikë.
Ndër shumë ndotës aromatikë, ne i kushtojmë vëmendje të veçantë PAH-ve me peshë të ulët molekulare, siç është naftalina dhe naftalenet e zëvendësuara. Këto komponime janë përbërës kryesorë të karburanteve të nxjerra nga nafta, ngjyrave tekstile, produkteve të konsumit, pesticideve (topave të naftalinës dhe repelentëve kundër insekteve), plastifikuesve dhe taninave dhe për këtë arsye janë të përhapura në shumë ekosisteme (Preuss et al., 2003). Raportet e fundit nxjerrin në pah akumulimin e përqendrimeve të naftalenit në sedimentet e akuifereve, ujërat nëntokësore dhe tokat nëntokësore, zonat vadoze dhe shtretërit e lumenjve, duke sugjeruar bioakumulimin e tij në mjedis (Duttagupta et al., 2019, 2020). Tabela 2 përmbledh vetitë fiziko-kimike, aplikimet dhe efektet shëndetësore të naftalenit dhe derivateve të tij. Krahasuar me PAH-të e tjera me peshë të lartë molekulare, naftaleni dhe derivatet e tij janë më pak hidrofobike, më të tretshme në ujë dhe të shpërndara gjerësisht në ekosisteme, kështu që ato shpesh përdoren si substrate model për të studiuar metabolizmin, gjenetikën dhe diversitetin metabolik të PAH-ve. Një numër i madh mikroorganizmash janë në gjendje të metabolizojnë naftalenin dhe derivatet e tij, dhe informacioni gjithëpërfshirës është i disponueshëm mbi rrugët e tyre metabolike, enzimat dhe tiparet rregullatore (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). Përveç kësaj, naftaleni dhe derivatet e tij janë përcaktuar si komponime prototipi për vlerësimin e ndotjes mjedisore për shkak të bollëkut dhe biodisponueshmërisë së tyre të lartë. Agjencia Amerikane e Mbrojtjes së Mjedisit vlerëson se nivelet mesatare të naftalenit janë 5.19 μg për metër kub nga tymi i cigareve, kryesisht nga djegia e paplotë, dhe 7.8 deri në 46 μg nga tymi anësor, ndërsa ekspozimi ndaj kreozotit dhe naftalenit është 100 deri në 10,000 herë më i lartë (Preuss et al. 2003). Naftaleni në veçanti është zbuluar se ka toksicitet respirator dhe kancerogjenitet specifik për speciet, rajonin dhe seksin. Bazuar në studimet në kafshë, Agjencia Ndërkombëtare për Kërkime mbi Kancerin (IARC) e ka klasifikuar naftalenin si një "kancerogjen të mundshëm njerëzor" (Grupi 2B)1. Ekspozimi ndaj naftalenave të zëvendësuara, kryesisht me anë të thithjes ose administrimit parenteral (oral), shkakton dëmtim të indeve të mushkërive dhe rrit incidencën e tumoreve të mushkërive tek minjtë dhe minjtë (Programi Kombëtar i Toksikologjisë 2). Efektet akute përfshijnë të përziera, të vjella, dhimbje barku, diarre, dhimbje koke, konfuzion, djersitje të tepërt, ethe, takikardi, etj. Nga ana tjetër, insekticidi karbamat me spektër të gjerë karbaril (1-naftil N-metilkarbamat) është raportuar të jetë toksik për jovertebrorët ujorë, amfibët, bletët e mjaltit dhe njerëzit dhe është treguar se pengon acetilkolinesterazën duke shkaktuar paralizë (Smulders et al., 2003; Bulen dhe Distel, 2011). Prandaj, të kuptuarit e mekanizmave të degradimit mikrobik, rregullimit gjenetik, reaksioneve enzimatike dhe qelizore është thelbësore për zhvillimin e strategjive të bioremediacionit në mjedise të kontaminuara.
Tabela 2. Informacion i detajuar mbi vetitë fiziko-kimike, përdorimet, metodat e identifikimit dhe sëmundjet shoqëruese të naftalenit dhe derivateve të tij.
Në kamare të ndotura, ndotësit aromatikë hidrofobë dhe lipofilë mund të shkaktojnë një sërë efektesh qelizore në mikrobiomën (komunitetin) mjedisor, të tilla si ndryshime në rrjedhshmërinë e membranës, përshkueshmërinë e membranës, ënjtjen e shtresës së dyfishtë lipidike, ndërprerjen e transferimit të energjisë (zinxhiri i transportit të elektroneve/forca lëvizëse e protonit) dhe aktivitetin e proteinave të shoqëruara me membranën (Sikkema et al., 1995). Përveç kësaj, disa ndërmjetës të tretshëm si katekoli dhe kinonet gjenerojnë specie reaktive të oksigjenit (ROS) dhe formojnë adukte me ADN-në dhe proteinat (Penning et al., 1999). Kështu, bollëku i komponimeve të tilla në ekosisteme ushtron presion selektiv mbi komunitetet mikrobike për t'u bërë degradues efikasë në nivele të ndryshme fiziologjike, duke përfshirë thithjen/transportimin, transformimin intraqelizor, asimilimin/shfrytëzimin dhe ndarjen.
Një kërkim në Projektin e Bazës së të Dhënave Ribosomale-II (RDP-II) zbuloi se një total prej 926 speciesh bakteriale u izoluan nga media ose kultura pasurimi të kontaminuara me naftalinë ose derivate të saj. Grupi Proteobacteria kishte numrin më të lartë të përfaqësuesve (n = 755), i ndjekur nga Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) dhe bakteret e paklasifikuara (8) (Figura 2). Përfaqësuesit e γ-Proteobacteria (Pseudomonadales dhe Xanthomonadales) dominuan të gjitha grupet Gram-negative me përmbajtje të lartë G+C (54%), ndërsa Clostridiales dhe Bacillales (30%) ishin grupe Gram-pozitive me përmbajtje të ulët G+C. Pseudomonas (numri më i lartë, 338 specie) u raportua se ishte në gjendje të degradonte naftalenin dhe derivatet e tij metil në ekosisteme të ndryshme të ndotura (katran qymyri, naftë, naftë bruto, llum, derdhje nafte, ujëra të zeza, mbetje organike dhe deponi), si dhe në ekosisteme të paprekura (tokë, lumenj, sedimente dhe ujëra nëntokësore) (Figura 2). Për më tepër, studimet e pasurimit dhe analiza metagenomike e disa prej këtyre rajoneve zbuluan se speciet e pakultivuara të Legionella dhe Clostridium mund të kenë kapacitet degradues, duke treguar nevojën për të kultivuar këto baktere për të studiuar rrugë të reja dhe diversitet metabolik.
Fig. 2. Diversiteti taksonomik dhe shpërndarja ekologjike e përfaqësuesve bakterialë në mjedise të kontaminuara me naftalinë dhe derivate të naftalinit.
Midis mikroorganizmave të ndryshëm aromatikë që degradojnë hidrokarburet, shumica janë të aftë të degradojnë naftalenin si burimin e vetëm të karbonit dhe energjisë. Sekuenca e ngjarjeve të përfshira në metabolizmin e naftalenit është përshkruar për Pseudomonas sp. (llojet: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 dhe CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 dhe lloje të tjera (ND6 dhe AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis dhe Zylstra, 2004; Sota et al., 2006; Metabolizmi iniciohet nga një dioksigjenazë shumëkomponentëshe [naftalen dioksigjenazë (NDO), një dioksigjenazë hidroksiluese e unazës] që katalizon oksidimin e njërës prej unazave aromatike të naftalenit duke përdorur oksigjenin molekular si substratin tjetër, duke e shndërruar naftalenin në cis-naftalendiol (Figura 3). Cis-dihidrodioli shndërrohet në 1,2-dihidroksinaftalen nga një dehidrogjenaza. Një dioksigjenazë që ndan unazën, 1,2-dihidroksinaftalen dioksigjenaza (12DHNDO), e shndërron 1,2-dihidroksinaftalenin në acid 2-hidroksikromen-2-karboksilik. Izomerizimi enzimatik cis-trans prodhon trans-o-hidroksibenzilidenipiruvat, i cili copëtohet nga hidrataza aldolaza në aldehid salicilik dhe piruvat. Piruvati i acidit organik ishte përbërja e parë C3 që rrjedh nga skeleti i karbonit të naftalenit dhe drejtohet në rrugën qendrore të karbonit. Përveç kësaj, saliciladehid dehidrogjenaza e varur nga NAD+ e shndërron saliciladehidin në acid salicilik. Metabolizmi në këtë fazë quhet "rruga e sipërme" e degradimit të naftalenit. Kjo rrugë është shumë e zakonshme në shumicën e baktereve që degradojnë naftalenin. Megjithatë, ka disa përjashtime; për shembull, në Bacillus hamburgii 2 termofilik, degradimi i naftalenit iniciohet nga naftalen 2,3-dioksigjenaza për të formuar 2,3-dihidroksinaftaleni (Annweiler et al., 2000).
Figura 3. Rrugët e degradimit të naftalenit, metilnaftalinës, acidit naftoik dhe karbarilit. Numrat e rrethuar përfaqësojnë enzimat përgjegjëse për shndërrimin sekuencial të naftalenit dhe derivateve të tij në produkte pasuese. 1 — naftalen dioksigjenaza (NDO); 2, cis-dihidrodiol dehidrogjenaza; 3, 1,2-dihidroksinaftalen dioksigjenaza; 4, izomeraza e acidit 2-hidroksikromen-2-karboksilik; 5, trans-O-hidroksibenzilidenepiruvat hidrataza aldolaza; 6, saliciladehid dehidrogjenaza; 7, salicilat 1-hidroksilaza; 8, katekol 2,3-dioksigjenaza (C23DO); 9, 2-hidroksimukonat semialdehid dehidrogjenaza; 10, 2-oksopent-4-enoat hidrataza; 11, 4-hidroksi-2-oksopentanoat aldolaza; 12, acetaldehid dehidrogjenaza; 13, katekol-1,2-dioksigjenaza (C12DO); 14, mukonat cikloizomeraza; 15, mukonolakton delta-izomeraza; 16, β-ketoadipatenolakton hidrolaza; 17, β-ketoadipat suksinil-CoA transferaza; 18, β-ketoadipat-CoA tiolaza; 19, suksinil-CoA: acetil-CoA suksiniltransferaza; 20, salicilat 5-hidroksilaza; 21 – gentisat 1,2-dioksigjenaza (GDO); 22, maleilpiruvat izomeraza; 23, fumarildpiruvat hidrolaza; 24, metilnaftalen hidroksilaza (NDO); 25, hidroksimetilnaftalen dehidrogjenaza; 26, naftaldehid dehidrogjenaza; 27, oksidaza e acidit 3-formilsalicilik; 28, dekarboksilaza e hidroksiizoftalatit; 29, hidrolaza e karbarilit (CH); 30, 1-naftol-2-hidroksilaza.
Në varësi të organizmit dhe përbërjes së tij gjenetike, acidi salicilik që rezulton metabolizohet më tej ose nëpërmjet rrugës së katekolit duke përdorur salicilat 1-hidroksilazën (S1H) ose nëpërmjet rrugës së gentisatit duke përdorur salicilat 5-hidroksilazën (S5H) (Figura 3). Meqenëse acidi salicilik është ndërmjetësi kryesor në metabolizmin e naftalenit (rruga e sipërme), hapat nga acidi salicilik në ndërmjetësin TCA shpesh quhen rruga e poshtme, dhe gjenet janë të organizuara në një operon të vetëm. Është e zakonshme të shihet se gjenet në operonin e rrugës së sipërme (nah) dhe operonin e rrugës së poshtme (sal) rregullohen nga faktorë të përbashkët rregullatorë; për shembull, NahR dhe acidi salicilik veprojnë si induktorë, duke lejuar që të dy operonët ta metabolizojnë plotësisht naftalenin (Phale et al., 2019, 2020).
Përveç kësaj, katekoli ndahet ciklikisht në 2-hidroksimukonat semialdehid nëpërmjet rrugës meta nga katekol 2,3-dioksigjenaza (C23DO) (Yen et al., 1988) dhe hidrolizohet më tej nga 2-hidroksimukonat semialdehid hidrolaza për të formuar acidin 2-hidroksipent-2,4-dienoik. 2-hidroksipent-2,4-dienoat më pas shndërrohet në piruvat dhe acetaldehid nga një hidratazë (2-oksopent-4-enoat hidrataza) dhe një aldolazë (4-hidroksi-2-oksopentanoat aldolaza) dhe më pas hyn në rrugën qendrore të karbonit (Figura 3). Nga ana tjetër, katekoli ndahet ciklikisht në cis,cis-mukonat nëpërmjet rrugës orto nga katekol 1,2-oksigjenaza (C12DO). Cikloizomeraza mukonat, izomeraza mukonolaktoni dhe β-ketoadipat-nolakton hidrolaza e shndërrojnë cis,cis-mukonatin në 3-oksoadipat, i cili hyn në rrugën qendrore të karbonit nëpërmjet sukcinil-CoA dhe acetil-CoA (Nozaki et al., 1968) (Figura 3).
Në rrugën e gentisatit (2,5-dihidroksibenzoat), unaza aromatike çahet nga gentisat 1,2-dioksigjenaza (GDO) për të formuar maleilpiruvat. Ky produkt mund të hidrolizohet direkt në piruvat dhe malat, ose mund të izomerizohet për të formuar fumaripiluvat, i cili më pas mund të hidrolizohet në piruvat dhe fumarat (Larkin dhe Day, 1986). Zgjedhja e rrugës alternative është vërejtur si në bakteret Gram-negative ashtu edhe në ato Gram-pozitive në nivele biokimike dhe gjenetike (Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997). Bakteret Gram-negative (Pseudomonas) preferojnë të përdorin acid salicilik, i cili është një induktor i metabolizmit të naftalenit, duke e dekarboksiluar atë në katekol duke përdorur salicilat 1-hidroksilazë (Gibson dhe Subramanian, 1984). Nga ana tjetër, te bakteret Gram-pozitive (Rhodococcus), salicilat 5-hidroksilaza e shndërron acidin salicilik në acid gentisik, ndërsa acidi salicilik nuk ka efekt induktiv në transkriptimin e gjeneve të naftalenit (Grund et al., 1992) (Figura 3).
Është raportuar se specie të tilla si Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas dhe speciet Mycobacterium mund të degradojnë monometilnaftalenin ose dimetilnaftalenin (Dean-Raymond dhe Bartha, 1975; Cane dhe Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999). Midis tyre, rruga e degradimit të 1-metilnaftalenit dhe 2-metilnaftalenit të Pseudomonas sp. CSV86 është studiuar qartë në nivele biokimike dhe enzimatike (Mahajan et al., 1994). 1-Metilnaftaleni metabolizohet nëpërmjet dy rrugëve. Së pari, unaza aromatike hidroksilohet (unaza e pazëvendësuar e metilnaftalenit) për të formuar cis-1,2-dihidroksi-1,2-dihidro-8-metilnaftalenin, i cili oksidohet më tej në salicilat metil dhe metilkatekol, dhe më pas hyn në rrugën qendrore të karbonit pas copëtimit të unazës (Figura 3). Kjo rrugë quhet "rruga e burimit të karbonit". Në "rrugën e dytë të detoksifikimit", grupi metil mund të hidroksilohet nga NDO për të formuar 1-hidroksimetilnaftalenin, i cili oksidohet më tej në acid 1-naftoik dhe ekskretohet në mjedisin e kulturës si një produkt pa rezultat. Studimet kanë treguar se lloji CSV86 nuk është në gjendje të rritet në acidin 1- dhe 2-naftoik si burimi i vetëm i karbonit dhe energjisë, duke konfirmuar rrugën e tij të detoksifikimit (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). Në 2-metilnaftalenin, grupi metil i nënshtrohet hidroksilimit nga hidroksilaza për të formuar 2-hidroksimetilnaftalenin. Përveç kësaj, unaza e pazëvendësuar e unazës së naftalenit i nënshtrohet hidroksilimit të unazës për të formuar një dihidrodiol, i cili oksidohet në 4-hidroksimetilkatekol në një seri reaksionesh të katalizuara nga enzimat dhe hyn në rrugën qendrore të karbonit nëpërmjet rrugës së copëtimit të meta-unazës. Në mënyrë të ngjashme, u raportua se S. paucimobilis 2322 përdor NDO për të hidroksiluar 2-metilnaftalenin, i cili oksidohet më tej për të formuar salicilat metil dhe metilkatekol (Dutta et al., 1998).
Acidet naftoike (të zëvendësuara/të pazëvendësuara) janë nënprodukte të detoksifikimit/biotransformimit të formuara gjatë degradimit të metilnaftalinës, fenantrenit dhe antracentenit dhe të lëshuara në mjedisin e kulturës së përdorur. Është raportuar se izolati i tokës Stenotrophomonas maltophilia CSV89 është në gjendje të metabolizojë acidin 1-naftoik si burim karboni (Phale et al., 1995). Metabolizmi fillon me dihidroksilimin e unazës aromatike për të formuar 1,2-dihidroksi-8-karboksinaftalenin. Dioli që rezulton oksidohet në katekol nëpërmjet 2-hidroksi-3-karboksibenzilidenepiruvatit, acidit 3-formilsalicilik, acidit 2-hidroksiizoftalik dhe acidit salicilik dhe hyn në rrugën qendrore të karbonit nëpërmjet rrugës së ndarjes së meta-unazës (Figura 3).
Karbarili është një pesticid naftil karbamat. Që nga Revolucioni i Gjelbër në Indi në vitet 1970, përdorimi i plehrave kimike dhe pesticideve ka çuar në një rritje të emetimeve të hidrokarbureve aromatike policiklike (PAH) nga burimet bujqësore jo-pikore (Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). Rreth 55% (85,722,000 hektarë) e tokës totale të mbjellë në Indi trajtohet me pesticide kimike. Gjatë pesë viteve të fundit (2015–2020), sektori i bujqësisë indiane ka përdorur mesatarisht 55,000 deri në 60,000 ton pesticide në vit (Departamenti i Kooperativave dhe Mirëqenies së Fermerëve, Ministria e Bujqësisë, Qeveria e Indisë, Gusht 2020). Në fushat veriore dhe qendrore të Gangetic (shtetet me popullsinë dhe dendësinë më të lartë të popullsisë), përdorimi i pesticideve në të korra është i përhapur, me mbizotërimin e insekticideve. Karbarili (1-naftil-N-metilkarbamati) është një insekticid karbamati me spektër të gjerë, mesatarisht deri në shumë toksik, që përdoret në bujqësinë indiane me një sasi mesatare prej 100-110 tonësh. Zakonisht shitet me emrin tregtar Sevin dhe përdoret për të kontrolluar insektet (afide, milingona zjarri, pleshtat, marimangat, merimangat dhe shumë dëmtues të tjerë të jashtëm) që prekin një sërë kulturash (misër, sojë, pambuk, fruta dhe perime). Disa mikroorganizma si Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus dhe Arthrobacter mund të përdoren gjithashtu për të kontrolluar dëmtues të tjerë. Është raportuar se RC100 mund të degradojë karbarilin (Larkin dhe Day, 1986; Chapalamadugu dhe Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha dhe Phale, 2005; Trivedi et al., 2017). Rruga e degradimit të karbarilit është studiuar gjerësisht në nivele biokimike, enzimatike dhe gjenetike në izolatet e tokës të Pseudomonas sp. Shtamet C4, C5 dhe C6 (Swetha dhe Phale, 2005; Trivedi et al., 2016) (Fig. 3). Rruga metabolike fillon me hidrolizën e lidhjes ester nga karbaril hidrolaza (CH4) për të formuar 1-naftol, metilaminë dhe dioksid karboni. 1-naftoli më pas shndërrohet në 1,2-dihidroksinaftalen nga 1-naftohidroksilaza (1-NH), e cila metabolizohet më tej nëpërmjet rrugës qendrore të karbonit nëpërmjet salicilatit dhe gentisatit. Disa baktere që degradojnë karbarilin janë raportuar se e metabolizojnë atë në acid salicilik nëpërmjet copëtimit të unazës orto të katekolit (Larkin dhe Day, 1986; Chapalamadugu dhe Chaudhry, 1991). Veçanërisht, bakteret që degradojnë naftalenin metabolizojnë kryesisht acidin salicilik nëpërmjet katekolit, ndërsa bakteret që degradojnë karbarilin preferojnë të metabolizojnë acidin salicilik nëpërmjet rrugës së gentisatit.
Acidi naftalensulfonik/acidi disulfonik dhe derivatet e acidit naftilaminosulfonik mund të përdoren si ndërmjetës në prodhimin e ngjyrave azo, agjentëve lagështues, shpërndarësve, etj. Edhe pse këto komponime kanë toksicitet të ulët për njerëzit, vlerësimet e citotoksicitetit kanë treguar se ato janë vdekjeprurëse për peshqit, dafnitë dhe algat (Greim et al., 1994). Përfaqësuesit e gjinisë Pseudomonas (llojet A3, C22) janë raportuar të fillojnë metabolizmin me anë të hidroksilimit të dyfishtë të unazës aromatike që përmban grupin e acidit sulfonik për të formuar një dihidrodiol, i cili shndërrohet më tej në 1,2-dihidroksinaftalen nga copëtimi spontan i grupit sulfit (Brilon et al., 1981). 1,2-dihidroksinaftaleni që rezulton katabolizohet nëpërmjet rrugës klasike të naftalenit, dmth., rrugës së katekolit ose gentisatit (Figura 4). Është treguar se acidi aminonaftalinsulfonik dhe acidi hidroksinaftalensulfonik mund të degradohen plotësisht nga konsorciume bakteriale të përziera me rrugë katabolike plotësuese (Nortemann et al., 1986). Është treguar se një anëtar i konsorciumit desulfurizon acidin aminonaftalinsulfonik ose acidin hidroksinaftalensulfonik me anë të 1,2-dioksigjenimit, ndërsa aminosalicilati ose hidroksisalicilati çlirohet në mjedisin e kulturës si një metabolit pa fund dhe më pas merret nga anëtarët e tjerë të konsorciumit. Acidi naftalenidisulfonik është relativisht polar, por biodegradohet dobët dhe për këtë arsye mund të metabolizohet nëpërmjet rrugëve të ndryshme. Desulfurizimi i parë ndodh gjatë dihidroksilimit regioselektiv të unazës aromatike dhe grupit të acidit sulfonik; Desulfurizimi i dytë ndodh gjatë hidroksilimit të acidit 5-sulfosalicilik nga 5-hidroksilaza e acidit salicilik për të formuar acidin gentisik, i cili hyn në rrugën qendrore të karbonit (Brilon et al., 1981) (Figura 4). Enzimat përgjegjëse për degradimin e naftalenit janë gjithashtu përgjegjëse për metabolizmin e sulfonatit të naftalenit (Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
Figura 4. Rrugët metabolike për degradimin e naftalen sulfonatit. Numrat brenda rrathëve përfaqësojnë enzimat përgjegjëse për metabolizmin e naftil sulfonatit, të ngjashme/identike me enzimat e përshkruara në FIG. 3.
PAH-të me peshë të ulët molekulare (LMW-PAH) janë të reduktueshme, hidrofobike dhe dobët të tretshme, dhe për këtë arsye nuk janë të ndjeshme ndaj zbërthimit/degradimit natyror. Megjithatë, mikroorganizmat aerobë janë në gjendje t'i oksidojnë ato duke thithur oksigjen molekular (O2). Këto enzima i përkasin kryesisht klasës së oksidoreduktazave dhe mund të kryejnë reaksione të ndryshme si hidroksilimi i unazës aromatike (mono- ose dihidroksilimi), dehidrogjenizimi dhe copëtimi i unazës aromatike. Produktet e përftuara nga këto reaksione janë në një gjendje më të lartë oksidimi dhe metabolizohen më lehtë përmes rrugës qendrore të karbonit (Phale et al., 2020). Enzimat në rrugën e degradimit janë raportuar të jenë të induktueshme. Aktiviteti i këtyre enzimave është shumë i ulët ose i papërfillshëm kur qelizat rriten në burime të thjeshta karboni si glukoza ose acidet organike. Tabela 3 përmbledh enzimat e ndryshme (oksigjenazat, hidrolazat, dehidrogjenazat, oksidazat, etj.) të përfshira në metabolizmin e naftalenit dhe derivateve të tij.
Tabela 3. Karakteristikat biokimike të enzimave përgjegjëse për degradimin e naftalenit dhe derivateve të tij.
Studimet radioizotopike (18O2) kanë treguar se përfshirja e O2 molekulare në unazat aromatike nga oksigjenazat është hapi më i rëndësishëm në aktivizimin e biodegradimit të mëtejshëm të një përbërjeje (Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955). Përfshirja e një atomi oksigjeni (O) nga oksigjeni molekular (O2) në substrat iniciohet nga monooksigjenazat endogjene ose ekzogjene (të quajtura edhe hidroksilaza). Një atom tjetër oksigjeni reduktohet në ujë. Monooksigjenazat ekzogjene reduktojnë flavinën me NADH ose NADPH, ndërsa në endomonooksigjenazat flavina reduktohet nga substrati. Pozicioni i hidroksilimit rezulton në diversitet në formimin e produktit. Për shembull, salicilat 1-hidroksilaza hidroksilon acidin salicilik në pozicionin C1, duke formuar katekol. Nga ana tjetër, salicilat 5-hidroksilaza shumëkomponentëshe (që përmban nënnjësi reduktaze, feredoksinë dhe oksigjenazë) hidroksilon acidin salicilik në pozicionin C5, duke formuar acid gentisik (Yamamoto et al., 1965).
Dioksigjenazat përfshijnë dy atome O2 në substrat. Në varësi të produkteve të formuara, ato ndahen në dioksigjenaza hidroksiluese të unazës dhe dioksigjenaza që copëtojnë unazën. Dioksigjenazat hidroksiluese të unazës i shndërrojnë substratet aromatike në cis-dihidrodiole (p.sh., naftalen) dhe janë të përhapura në mesin e baktereve. Deri më sot, është treguar se organizmat që përmbajnë dioksigjenaza hidroksiluese të unazës janë të aftë të rriten në burime të ndryshme aromatike të karbonit, dhe këto enzima klasifikohen si NDO (naftalin), toluen dioksigjenazë (TDO, toluen) dhe bifenil dioksigjenazë (BPDO, bifenil). Si NDO ashtu edhe BPDO mund të katalizojnë oksidimin e dyfishtë dhe hidroksilimin e zinxhirit anësor të hidrokarbureve të ndryshme aromatike policiklike (toluen, nitrotoluen, ksilen, etilbenzen, naftalen, bifenil, fluoren, indol, metilnaftalen, naftalensulfonat, fenantren, antracen, acetofenon, etj.) (Boyd dhe Sheldrake, 1998; Phale et al., 2020). NDO është një sistem shumëkomponentësh që përbëhet nga një oksidoreduktazë, një ferredoksinë dhe një komponent oksigjenaze që përmban vendin aktiv (Gibson dhe Subramanian, 1984; Resnick et al., 1996). Njësia katalitike e NDO përbëhet nga një nënnjësi e madhe α dhe një nënnjësi e vogël β të rregulluara në një konfigurim α3β3. NDO bën pjesë në një familje të madhe oksigjenazash dhe nën-njësia e saj α përmban një vend Rieske [2Fe-2S] dhe një hekur mononuklear jo-hem, i cili përcakton specifikën e substratit të NDO-së (Parales et al., 1998). Në mënyrë tipike, në një cikël katalitik, dy elektrone nga reduktimi i nukleotidit të piridinës transferohen në jonin Fe(II) në vendin aktiv nëpërmjet një reduktaze, një ferredoksine dhe një vendi Rieske. Ekuivalentët reduktues aktivizojnë oksigjenin molekular, i cili është një parakusht për dihidroksilimin e substratit (Ferraro et al., 2005). Deri më sot, vetëm disa NDO janë pastruar dhe karakterizuar në detaje nga lloje të ndryshme dhe kontrolli gjenetik i shtigjeve të përfshira në degradimin e naftalenit është studiuar në detaje (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). Dioksigjenazat që copëtojnë unazën (enzimat endo- ose orto-copëtuese të unazës dhe enzimat ekzodiol- ose meta-copëtuese të unazës) veprojnë mbi komponimet aromatike të hidroksiluara. Për shembull, dioksigjenaza orto-copëtuese e unazës është katekol-1,2-dioksigjenaza, ndërsa dioksigjenaza meta-copëtuese e unazës është katekol-2,3-dioksigjenaza (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). Përveç oksigjenazave të ndryshme, ekzistojnë edhe dehidrogjenaza të ndryshme përgjegjëse për dehidrogjenizimin e dihidrodioleve aromatike, alkooleve dhe aldehideve dhe duke përdorur NAD+/NADP+ si pranues elektronesh, të cilat janë disa nga enzimat e rëndësishme të përfshira në metabolizëm (Gibson dhe Subramanian, 1984; Shaw dhe Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
Enzima të tilla si hidrolazat (esterazat, amidazat) janë një klasë e dytë e rëndësishme e enzimave që përdorin ujin për të copëtuar lidhjet kovalente dhe shfaqin specifikë të gjerë të substratit. Karbaril hidrolaza dhe hidrolazat e tjera konsiderohen si përbërës të periplazmës (transmembranës) në anëtarët e baktereve Gram-negative (Kamini et al., 2018). Karbarili ka si një lidhje amidi ashtu edhe një esteri; prandaj, mund të hidrolizohet nga esteraza ose amidaza për të formuar 1-naftol. Karbarili në llojin Rhizobium rhizobium AC10023 dhe llojin Arthrobacter RC100 është raportuar të funksionojë përkatësisht si esterazë dhe amidazë. Karbarili në llojin Arthrobacter RC100 gjithashtu funksionon si një amidazë. RC100 është treguar se hidrolizon katër insekticide të klasës N-metilkarbamat si karbarili, metomili, acidi mefenamik dhe XMC (Hayaatsu et al., 2001). Është raportuar se CH në Pseudomonas sp. C5pp mund të veprojë në karbaril (aktivitet 100%) dhe acetat 1-naftil (aktivitet 36%), por jo në 1-naftilacetamid, duke treguar se është një esterazë (Trivedi et al., 2016).
Studimet biokimike, modelet e rregullimit të enzimave dhe analizat gjenetike kanë treguar se gjenet e degradimit të naftalenit përbëhen nga dy njësi rregullatore të induktueshme ose "operone": nah ("rruga e rrjedhës së sipërme", që e shndërron naftalenin në acid salicilik) dhe sal ("rruga e rrjedhës së poshtme", që e shndërron acidin salicilik në rrugën qendrore të karbonit nëpërmjet katekolit). Acidi salicilik dhe analogët e tij mund të veprojnë si induktorë (Shamsuzzaman dhe Barnsley, 1974). Në prani të glukozës ose acideve organike, operoni shtypet. Figura 5 tregon organizimin e plotë gjenetik të degradimit të naftalenit (në formën e operonit). Disa variante/forma të emërtuara të gjenit nah (ndo/pah/dox) janë përshkruar dhe janë gjetur të kenë homologji të lartë sekuence (90%) midis të gjitha specieve Pseudomonas (Abbasian et al., 2016). Gjenet e rrugës së rrjedhës së sipërme të naftalenit ishin përgjithësisht të rregulluara në një rend konsensusi siç tregohet në Figurën 5A. Një gjen tjetër, nahQ, u raportua gjithashtu se ishte i përfshirë në metabolizmin e naftalenit dhe zakonisht ndodhej midis nahC dhe nahE, por funksioni i tij aktual mbetet për t'u sqaruar. Në mënyrë të ngjashme, gjeni nahY, përgjegjës për kemotaksinë e ndjeshme ndaj naftalenit, u gjet në skajin distal të operonit nah në disa anëtarë. Në Ralstonia sp., gjeni U2 që kodon glutation S-transferazën (gsh) u gjet se ndodhej midis nahAa dhe nahAb, por nuk ndikoi në karakteristikat e shfrytëzimit të naftalenit (Zylstra et al., 1997).
Figura 5. Organizimi gjenetik dhe diversiteti i vëzhguar gjatë degradimit të naftalenit midis specieve bakteriale; (A) Rruga e sipërme e naftalenit, metabolizmi i naftalenit në acid salicilik; (B) Rruga e poshtme e naftalenit, acidi salicilik nëpërmjet katekolit në rrugën qendrore të karbonit; (C) acidi salicilik nëpërmjet gentisatit në rrugën qendrore të karbonit.
"Rruga e poshtme" (operoni sal) zakonisht përbëhet nga nahGTHINLMOKJ dhe e shndërron salicilatin në piruvat dhe acetaldehid nëpërmjet rrugës së copëtimit me katekol. Gjeni nahG (që kodon hidroksilazën e salicilatit) u gjet i konservuar në fundin proksimal të operonit (Fig. 5B). Krahasuar me llojet e tjera që degradojnë naftalenin, në P. putida CSV86 operonët nah dhe sal janë në tandem dhe shumë të lidhur ngushtë (rreth 7.5 kb). Në disa baktere Gram-negative, të tilla si Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 dhe P. putida AK5, naftaleni metabolizohet si një metabolit qendror i karbonit nëpërmjet rrugës gentisate (në formën e operonit sgp/nag). Kaseta e gjenit përfaqësohet zakonisht në formën nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, ku nagR (që kodon një rregullator të tipit LysR) ndodhet në skajin e sipërm (Figura 5C).
Karbarili hyn në ciklin qendror të karbonit nëpërmjet metabolizmit të 1-naftolit, 1,2-dihidroksinaftalenit, acidit salicilik dhe acidit gentisik (Figura 3). Bazuar në studimet gjenetike dhe metabolike, është propozuar që kjo rrugë të ndahet në "rrjedhën e sipërme" (konvertimi i karbarilit në acid salicilik), "të mesme" (konvertimi i acidit salicilik në acid gentisik) dhe "në rrjedhën e poshtme" (konvertimi i acidit gentisik në ndërmjetës të rrugës qendrore të karbonit) (Singh et al., 2013). Analiza gjenomike e C5pp (supercontig A, 76.3 kb) zbuloi se gjeni mcbACBDEF është i përfshirë në konvertimin e karbarilit në acid salicilik, i ndjekur nga mcbIJKL në konvertimin e acidit salicilik në acid gentisik dhe mcbOQP në konvertimin e acidit gentisik në ndërmjetës të karbonit qendror (fumarat dhe piruvat, Trivedi et al., 2016) (Figura 6).
Është raportuar se enzimat e përfshira në degradimin e hidrokarbureve aromatike (duke përfshirë naftalenin dhe acidin salicilik) mund të induktohen nga komponimet përkatëse dhe të frenohen nga burime të thjeshta karboni si glukoza ose acidet organike (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). Ndër rrugët e ndryshme metabolike të naftalenit dhe derivateve të tij, tiparet rregullatore të naftalenit dhe karbarilit janë studiuar deri diku. Për naftalenin, gjenet në të dyja rrugët, si në rrjedhën e sipërme ashtu edhe në atë të poshtme, rregullohen nga NahR, një rregullator pozitiv trans-veprues i tipit LysR. Është i nevojshëm për induksionin e gjenit nah nga acidi salicilik dhe shprehja e tij e mëvonshme në nivel të lartë (Yen dhe Gunsalus, 1982). Për më tepër, studimet kanë treguar se faktori integrues pritës (IHF) dhe XylR (rregullatori transkriptues i varur nga sigma 54) janë gjithashtu kritikë për aktivizimin transkriptues të gjeneve në metabolizmin e naftalenit (Ramos et al., 1997). Studimet kanë treguar se enzimat e rrugës së hapjes së meta-unazës së katekolit, përkatësisht katekol 2,3-dioksigjenaza, induktohen në prani të naftalenit dhe/ose acidit salicilik (Basu et al., 2006). Studimet kanë treguar se enzimat e rrugës së hapjes së orto-unazës së katekolit, përkatësisht katekol 1,2-dioksigjenaza, induktohen në prani të acidit benzoik dhe cis,cis-mukonatit (Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001).
Në llojin C5pp, pesë gjene, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR dhe mcbS, kodojnë rregullatorë që i përkasin familjes LysR/TetR të rregullatorëve transkriptues përgjegjës për kontrollin e degradimit të karbarilit. Gjeni homolog mcbG u gjet të jetë më i lidhur ngushtë me rregullatorin e tipit LysR PhnS (identitet aminoacidesh 58%) të përfshirë në metabolizmin e fenantrenit në Burkholderia RP00725 (Trivedi et al., 2016). Gjeni mcbH u gjet të jetë i përfshirë në rrugën e ndërmjetme (konvertimi i acidit salicilik në acid gentisik) dhe i përket rregullatorit transkriptues të tipit LysR NagR/DntR/NahR në Pseudomonas dhe Burkholderia. Anëtarët e kësaj familjeje u raportuan se e njohin acidin salicilik si një molekulë efektore specifike për induksionin e gjeneve të degradimit. Nga ana tjetër, tre gjene, mcbN, mcbR dhe mcbS, që i përkasin rregullatorëve transkriptues të tipit LysR dhe TetR, u identifikuan në rrugën e poshtme (metabolitët e rrugës qendrore të karbonit-gentisate).
Tek prokariotët, proceset horizontale të transferimit të gjeneve (fitimi, shkëmbimi ose transferimi) nëpërmjet plazmideve, transpozoneve, profagëve, ishujve gjenomikë dhe elementëve integrues konjugues (ICE) janë shkaqet kryesore të plasticitetit në gjenomet bakteriale, duke çuar në fitimin ose humbjen e funksioneve/tipareve specifike. Kjo i lejon bakteret të përshtaten me shpejtësi me kushtet e ndryshme mjedisore, duke ofruar avantazhe të mundshme metabolike adaptive për strehuesin, siç është degradimi i komponimeve aromatike. Ndryshimet metabolike shpesh arrihen nëpërmjet rregullimit të imët të operoneve të degradimit, mekanizmave të tyre rregullatorë dhe specifikave të enzimave, gjë që lehtëson degradimin e një game më të gjerë të komponimeve aromatike (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). Kasetat e gjeneve për degradimin e naftalenit janë gjetur të jenë të vendosura në një sërë elementësh të lëvizshëm siç janë plazmidet (konjuguese dhe jo-konjuguese), transpozonet, gjenomet, ICE-të dhe kombinimet e specieve të ndryshme bakteriale (Figura 5). Në Pseudomonas G7, operonet nah dhe sal të plazmidit NAH7 transkriptohen në të njëjtin orientim dhe janë pjesë e një transpozoni difektoz që kërkon transpozazën Tn4653 për mobilizim (Sota et al., 2006). Në llojin Pseudomonas NCIB9816-4, gjeni u gjet në plazmidin konjugativ pDTG1 si dy operone (afërsisht 15 kb larg njëri-tjetrit) që u transkriptuan në drejtime të kundërta (Dennis dhe Zylstra, 2004). Në llojin Pseudomonas putida AK5, plazmidi jo-konjugativ pAK5 kodon enzimën përgjegjëse për degradimin e naftalenit nëpërmjet rrugës së gentisatit (Izmalkova et al., 2013). Në llojin Pseudomonas PMD-1, operoni nah ndodhet në kromozom, ndërsa operoni sal ndodhet në plazmidin konjugativ pMWD-1 (Zuniga et al., 1981). Megjithatë, në Pseudomonas stutzeri AN10, të gjitha gjenet e degradimit të naftalenit (operonet nah dhe sal) janë të vendosura në kromozom dhe me sa duket rekrutohen përmes ngjarjeve të transpozicionit, rekombinimit dhe rirregullimit (Bosch et al., 2000). Në Pseudomonas sp. CSV86, operonet nah dhe sal janë të vendosura në gjenom në formën e ICE (ICECSV86). Struktura mbrohet nga tRNAGly e ndjekur nga përsëritje të drejtpërdrejta që tregojnë vende rekombinimi/bashkëngjitjeje (attR dhe attL) dhe një integrazë e ngjashme me fagun e vendosur në të dy skajet e tRNAGly, kështu strukturalisht e ngjashme me elementin ICEclc (ICEclcB13 në Pseudomonas knackmusii për degradimin e klorokatekolit). Është raportuar se gjenet në ICE mund të transferohen me anë të konjugimit me një frekuencë transferimi jashtëzakonisht të ulët (10-8), duke transferuar kështu vetitë e degradimit te marrësi (Basu dhe Phale, 2008; Phale et al., 2019).
Shumica e gjeneve përgjegjëse për degradimin e karbarilit ndodhen në plazmide. Arthrobacter sp. RC100 përmban tre plazmide (pRC1, pRC2 dhe pRC300) nga të cilat dy plazmide konjugative, pRC1 dhe pRC2, kodojnë enzimat që shndërrojnë karbarilin në gentizat. Nga ana tjetër, enzimat e përfshira në konvertimin e gentizatit në metabolitët qendrorë të karbonit ndodhen në kromozom (Hayaatsu et al., 1999). Bakteret e gjinisë Rhizobium. Shtami AC100, i përdorur për konvertimin e karbarilit në 1-naftol, përmban plazmidin pAC200, i cili mbart gjenin cehA që kodon CH si pjesë të transpozonit Tnceh të rrethuar nga sekuenca të ngjashme me elementin e futjes (istA dhe istB) (Hashimoto et al., 2002). Në llojin Sphingomonas CF06, besohet se gjeni i degradimit të karbarilit është i pranishëm në pesë plazmide: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 dhe pCF05. Homologjia e ADN-së së këtyre plazmideve është e lartë, duke treguar ekzistencën e një ngjarjeje të dyfishimit të gjenit (Feng et al., 1997). Në një simbiont që degradon karbarilin të përbërë nga dy specie Pseudomonas, lloji 50581 përmban një plazmid konjugativ pCD1 (50 kb) që kodon gjenin mcd karbaril hidrolazë, ndërsa plazmidet konjugativ në llojin 50552 kodojnë një enzimë që degradon 1-naftol (Chapalamadugu dhe Chaudhry, 1991). Në llojin Achromobacter WM111, gjeni mcd furadan hidrolazë ndodhet në një plazmid 100 kb (pPDL11). Ky gjen është treguar të jetë i pranishëm në plazmide të ndryshme (100, 105, 115 ose 124 kb) në baktere të ndryshme nga rajone të ndryshme gjeografike (Parekh et al., 1995). Në Pseudomonas sp. C5pp, të gjitha gjenet përgjegjëse për degradimin e karbarilit ndodhen në një gjenom që përfshin 76.3 kb sekuencë (Trivedi et al., 2016). Analiza e gjenomit (6.15 Mb) zbuloi praninë e 42 MGE-ve dhe 36 GEI-ve, nga të cilat 17 MGE ishin të vendosura në superkontigun A (76.3 kb) me një përmbajtje mesatare asimetrike G+C (54-60 mol%), duke sugjeruar ngjarje të mundshme të transferimit horizontal të gjeneve (Trivedi et al., 2016). P. putida XWY-1 shfaq një rregullim të ngjashëm të gjeneve që degradojnë karbarilin, por këto gjene ndodhen në një plazmid (Zhu et al., 2019).
Përveç efikasitetit metabolik në nivele biokimike dhe gjenomike, mikroorganizmat shfaqin edhe veti ose përgjigje të tjera, të tilla si kemotaksia, vetitë e modifikimit të sipërfaqes qelizore, ndarjen, shfrytëzimin preferencial, prodhimin e biosurfaktantëve, etj., të cilat i ndihmojnë ata të metabolizojnë në mënyrë më efikase ndotësit aromatikë në mjedise të kontaminuara (Figura 7).
Figura 7. Strategji të ndryshme të reagimit qelizor të baktereve ideale aromatike që degradojnë hidrokarburet për biodegradim efikas të përbërjeve ndotëse të huaja.
Përgjigjet kemotaktike konsiderohen si faktorë që rrisin degradimin e ndotësve organikë në ekosistemet heterogjene të ndotura. (2002) treguan se kemotaksia e Pseudomonas sp. G7 në naftalinë rriti shkallën e degradimit të naftalinës në sistemet ujore. Lloji i tipit të egër G7 e degradoi naftalinë shumë më shpejt sesa një lloj mutant me mungesë kemotaksi. Proteina NahY (538 aminoacide me topologji membranore) u gjet se bashkë-transkriptohej me gjenet e rrugës së metakapjes në plazmidin NAH7, dhe ashtu si transduktorët e kemotaksisë, kjo proteinë duket se funksionon si një kemoreceptor për degradimin e naftalinës (Grimm dhe Harwood 1997). Një studim tjetër nga Hansel et al. (2009) tregoi se proteina është kemotaktike, por shkalla e degradimit të saj është e lartë. (2011) demonstruan një përgjigje kemotaktike të Pseudomonas (P. putida) ndaj naftalenit të gaztë, ku difuzioni në fazën e gazit rezultoi në një rrjedhë të qëndrueshme të naftalenit në qeliza, e cila kontrollonte përgjigjen kemotaktike të qelizave. Studiuesit e shfrytëzuan këtë sjellje kemotaktike për të projektuar mikrobe që do të rrisnin shkallën e degradimit. Studimet kanë treguar se rrugët kemosensore rregullojnë edhe funksione të tjera qelizore, të tilla si ndarja qelizore, rregullimi i ciklit qelizor dhe formimi i biofilmit, duke ndihmuar kështu në kontrollin e shkallës së degradimit. Megjithatë, shfrytëzimi i kësaj vetie (kemotaksa) për degradim efikas pengohet nga disa pengesa. Pengesa kryesore janë: (a) receptorët e ndryshëm paralogë njohin të njëjtat komponime/ligandë; (b) ekzistenca e receptorëve alternativë, d.m.th., tropizmi energjik; (c) ndryshime të rëndësishme në sekuencë në domenet shqisore të së njëjtës familje receptorësh; dhe (d) mungesa e informacionit mbi proteinat kryesore sensorike bakteriale (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). Ndonjëherë, biodegradimi i hidrokarbureve aromatike prodhon metabolitë/produkte të ndërmjetme të shumëfishta, të cilat mund të jenë kemotaktike për një grup bakteresh, por të neveritshme për të tjerat, duke e komplikuar më tej procesin. Për të identifikuar ndërveprimet e ligandeve (hidrokarbureve aromatike) me receptorët kimikë, ne ndërtuam proteina hibride sensorësh (PcaY, McfR dhe NahY) duke bashkuar domenet sensorë dhe sinjalizues të Pseudomonas putida dhe Escherichia coli, të cilat synojnë receptorët për acidet aromatike, ndërmjetësit TCA dhe naftalenin, përkatësisht (Luu et al., 2019).
Nën ndikimin e naftalenit dhe hidrokarbureve të tjera aromatike policiklike (PAH), struktura e membranës bakteriale dhe integriteti i mikroorganizmave pësojnë ndryshime të rëndësishme. Studimet kanë treguar se naftaleni ndërhyn në bashkëveprimin e zinxhirit acil përmes bashkëveprimeve hidrofobike, duke rritur kështu ënjtjen dhe rrjedhshmërinë e membranës (Sikkema et al., 1995). Për të kundërshtuar këtë efekt të dëmshëm, bakteret rregullojnë rrjedhshmërinë e membranës duke ndryshuar raportin dhe përbërjen e acideve yndyrore midis acideve yndyrore me zinxhir të degëzuar izo/anteizo dhe duke izomerizuar acidet yndyrore cis-të pangopura në izomerët përkatës trans (Heipieper dhe de Bont, 1994). Në Pseudomonas stutzeri të rritur me trajtim me naftalen, raporti i acideve yndyrore të ngopura me të pangopura u rrit nga 1.1 në 2.1, ndërsa në Pseudomonas JS150 ky raport u rrit nga 7.5 në 12.0 (Mrozik et al., 2004). Kur u rritën në naftalinë, qelizat Achromobacter KAs 3-5 shfaqën grumbullim qelizor rreth kristaleve të naftalinit dhe një rënie në ngarkesën sipërfaqësore të qelizës (nga -22.5 në -2.5 mV) të shoqëruar nga kondensimi dhe vakuolizimi citoplazmatik, duke treguar ndryshime në strukturën qelizore dhe vetitë e sipërfaqes së qelizës (Mohapatra et al., 2019). Megjithëse ndryshimet qelizore/sipërfaqësore shoqërohen drejtpërdrejt me thithjen më të mirë të ndotësve aromatikë, strategjitë përkatëse të bioinxhinierisë nuk janë optimizuar plotësisht. Manipulimi i formës së qelizës është përdorur rrallë për të optimizuar proceset biologjike (Volke dhe Nikel, 2018). Fshirja e gjeneve që ndikojnë në ndarjen e qelizave shkakton ndryshime në morfologjinë e qelizave. Fshirja e gjeneve që ndikojnë në ndarjen e qelizave shkakton ndryshime në morfologjinë e qelizave. Në Bacillus subtilis, proteina e septumit qelizor SepF është treguar se është e përfshirë në formimin e septumit dhe është e nevojshme për hapat pasues të ndarjes së qelizave, por nuk është një gjen thelbësor. Fshirja e gjeneve që kodojnë hidrolazat e glikanit peptid në Bacillus subtilis rezultoi në zgjatje të qelizave, rritje të shkallës specifike të rritjes dhe përmirësim të kapacitetit të prodhimit të enzimave (Cui et al., 2018).
Është propozuar ndarje e rrugës së degradimit të karbarilit për të arritur degradim efikas të llojeve të Pseudomonas C5pp dhe C7 (Kamini et al., 2018). Është propozuar që karbarili të transportohet në hapësirën periplazmike përmes septumit të membranës së jashtme dhe/ose përmes porinave të difuzueshme. CH është një enzimë periplazmike që katalizon hidrolizën e karbarilit në 1-naftol, i cili është më i qëndrueshëm, më hidrofobik dhe më toksik. CH është i lokalizuar në periplazmë dhe ka një afinitet të ulët për karbarilin, duke kontrolluar kështu formimin e 1-naftolit, duke parandaluar kështu akumulimin e tij në qeliza dhe duke zvogëluar toksicitetin e tij për qelizat (Kamini et al., 2018). 1-naftoli që rezulton transportohet në citoplazmë përmes membranës së brendshme duke u ndarë dhe/ose duke u difuzuar, dhe më pas hidroksilohet në 1,2-dihidroksinaftalen nga enzima me afinitet të lartë 1NH për metabolizëm të mëtejshëm në rrugën qendrore të karbonit.
Edhe pse mikroorganizmat kanë aftësitë gjenetike dhe metabolike për të degraduar burimet ksenobiotike të karbonit, struktura hierarkike e përdorimit të tyre (domethënë, përdorimi preferencial i burimeve të thjeshta të karbonit mbi ato komplekse) është një pengesë e madhe për biodegradimin. Prania dhe përdorimi i burimeve të thjeshta të karbonit ul gjenet që kodojnë enzimat që degradojnë burimet komplekse/jo të preferuara të karbonit, siç janë PAH-të. Një shembull i studiuar mirë është se kur glukoza dhe laktoza i bashkëushqehen Escherichia coli-t, glukoza përdoret më me efikasitet sesa laktoza (Jacob dhe Monod, 1965). Pseudomonas është raportuar të degradojë një sërë PAH-sh dhe komponimesh ksenobiotike si burime karboni. Hierarkia e përdorimit të burimeve të karbonit në Pseudomonas është acide organike > glukozë > komponime aromatike (Hylemon dhe Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). Megjithatë, ekziston një përjashtim. Është interesante se Pseudomonas sp. CSV86 shfaq një strukturë unike hierarkike që përdor në mënyrë të preferueshme hidrokarburet aromatike (acid benzoik, naftalen, etj.) në vend të glukozës dhe bashkë-metabolizon hidrokarburet aromatike me acide organike (Basu et al., 2006). Në këtë bakter, gjenet për degradimin dhe transportin e hidrokarbureve aromatike nuk ulen edhe në prani të një burimi të dytë karboni si glukoza ose acidet organike. Kur u rrit në një mjedis me glukozë dhe hidrokarbure aromatike, u vu re se gjenet për transportin dhe metabolizmin e glukozës u ulën, hidrokarburet aromatike u përdorën në fazën e parë logaritmike, dhe glukoza u përdor në fazën e dytë logaritmike (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). Nga ana tjetër, prania e acideve organike nuk ndikoi në shprehjen e metabolizmit të hidrokarbureve aromatike, kështu që ky bakter pritet të jetë një lloj kandidat për studime të biodegradimit (Phale et al., 2020).
Dihet mirë se biotransformimi i hidrokarbureve mund të shkaktojë stres oksidativ dhe rritje të enzimave antioksiduese në mikroorganizma. Biodegradimi joefikas i naftalenit si në qelizat e fazës stacionare ashtu edhe në prani të komponimeve toksike çon në formimin e specieve reaktive të oksigjenit (ROS) (Kang et al. 2006). Meqenëse enzimat që zbërthejnë naftalenin përmbajnë grumbuj hekur-squfur, nën stres oksidativ, hekuri në proteinat e hemës dhe hekur-squfur do të oksidohet, duke çuar në inaktivizimin e proteinave. Ferredoksin-NADP+ reduktaza (Fpr), së bashku me superoksid dismutazën (SOD), ndërmjetëson reaksionin redoks të kthyeshëm midis NADP+/NADPH dhe dy molekulave të feredoksinës ose flavodoksinës, duke pastruar kështu ROS dhe duke rikthyer qendrën hekur-squfur nën stres oksidativ (Li et al. 2006). Është raportuar se si Fpr ashtu edhe SodA (SOD) te Pseudomonas mund të induktohen nga stresi oksidativ, dhe aktivitete të rritura të SOD dhe katalazës u vunë re në katër lloje Pseudomonas (O1, W1, As1 dhe G1) gjatë rritjes në kushte të shtuara me naftalinë (Kang et al., 2006). Studimet kanë treguar se shtimi i antioksidantëve si acidi askorbik ose hekuri ferroz (Fe2+) mund të rrisë shkallën e rritjes së naftalinës. Kur Rhodococcus erythropolis u rrit në mjedis naftalini, transkriptimi i gjeneve të citokromit P450 të lidhura me stresin oksidativ, duke përfshirë sodA (superoksid dismutaza Fe/Mn), sodC (superoksid dismutaza Cu/Zn) dhe recA u rrit (Sazykin et al., 2019). Analiza krahasuese sasiore proteomike e qelizave Pseudomonas të kultivuara në naftalinë tregoi se rritja e proteinave të ndryshme të shoqëruara me përgjigjen ndaj stresit oksidativ është një strategji përballimi e stresit (Herbst et al., 2013).
Mikroorganizmat janë raportuar se prodhojnë biosurfaktantë nën veprimin e burimeve hidrofobike të karbonit. Këta surfaktantë janë komponime sipërfaqësore aktive amfifile që mund të formojnë agregate në ndërfaqet vaj-ujë ose ajër-ujë. Kjo nxit pseudo-tretshmërinë dhe lehtëson adsorbimin e hidrokarbureve aromatike, duke rezultuar në biodegradim efikas (Rahman et al., 2002). Për shkak të këtyre vetive, biosurfaktantët përdoren gjerësisht në industri të ndryshme. Shtimi i surfaktantëve kimikë ose biosurfaktantëve në kulturat bakteriale mund të rrisë efikasitetin dhe shkallën e degradimit të hidrokarbureve. Ndër biosurfaktantët, ramnolipidet e prodhuara nga Pseudomonas aeruginosa janë studiuar dhe karakterizuar gjerësisht (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). Përveç kësaj, lloje të tjera të biosurfaktantëve përfshijnë lipopeptidet (mucinat nga Pseudomonas fluorescens), emulsifikuesin 378 (nga Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg dhe Ron, 1999), lipidet disakaride të trehalozës nga Rhodococcus (Ramdahl, 1985), likeninën nga Bacillus (Saraswathy dhe Hallberg, 2002) dhe surfaktantin nga Bacillus subtilis (Siegmund dhe Wagner, 1991) dhe Bacillus amyloliquefaciens (Zhi et al., 2017). Këta surfaktantë të fuqishëm kanë treguar se zvogëlojnë tensionin sipërfaqësor nga 72 dyne/cm në më pak se 30 dyne/cm, duke lejuar një thithje më të mirë të hidrokarbureve. Është raportuar se Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia dhe specie të tjera bakteriale mund të prodhojnë biosurfaktantë të ndryshëm me bazë ramnolipidesh dhe glikolipidesh kur rriten në mjedise naftalini dhe metilnaftalini (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89 mund të prodhojë biosurfaktantin jashtëqelizor Biosur-Pm kur rritet në komponime aromatike siç është acidi naftoik (Phale et al., 1995). Kinetika e formimit të Biosur-Pm tregoi se sinteza e tij është një proces i varur nga rritja dhe pH. U zbulua se sasia e Biosur-Pm e prodhuar nga qelizat në pH neutral ishte më e lartë se ajo në pH 8.5. Qelizat e rritura në pH 8.5 ishin më hidrofobe dhe kishin afinitet më të lartë për komponimet aromatike dhe alifatike sesa qelizat e rritura në pH 7.0. Në Rhodococcus spp. N6, raporti më i lartë i karbonit ndaj azotit (C:N) dhe kufizimi i hekurit janë kushte optimale për prodhimin e biosurfaktantëve jashtëqelizorë (Mutalik et al., 2008). Janë bërë përpjekje për të përmirësuar biosintezën e biosurfaktantëve (surfaktinave) duke optimizuar llojet dhe fermentimin. Megjithatë, titri i surfaktantit në mjedisin e kulturës është i ulët (1.0 g/L), gjë që përbën një sfidë për prodhimin në shkallë të gjerë (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Prandaj, janë përdorur metoda të inxhinierisë gjenetike për të përmirësuar biosintezën e tij. Megjithatë, modifikimi i tij inxhinierik është i vështirë për shkak të madhësisë së madhe të operonit (∼25 kb) dhe rregullimit kompleks biosintetik të sistemit të ndjeshmërisë së kuorumit (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Një numër modifikimesh të inxhinierisë gjenetike janë kryer në bakteret Bacillus, kryesisht me qëllim rritjen e prodhimit të surfaktinës duke zëvendësuar promotorin (operoni srfA), duke shprehur tepër proteinën eksportuese të surfaktinës YerP dhe faktorët rregullatorë ComX dhe PhrC (Jiao et al., 2017). Megjithatë, këto metoda të inxhinierisë gjenetike kanë arritur vetëm një ose disa modifikime gjenetike dhe ende nuk kanë arritur prodhimin komercial. Prandaj, është i nevojshëm studimi i mëtejshëm i metodave të optimizimit të bazuara në njohuri.
Studimet e biodegradimit të PAH-ve kryhen kryesisht në kushte standarde laboratorike. Megjithatë, në vendet e kontaminuara ose në mjedise të kontaminuara, shumë faktorë abiotikë dhe biotikë (temperatura, pH, oksigjeni, disponueshmëria e lëndëve ushqyese, biodisponueshmëria e substratit, ksenobiotikë të tjerë, frenimi i produktit përfundimtar, etj.) kanë treguar se ndryshojnë dhe ndikojnë në kapacitetin degradues të mikroorganizmave.
Temperatura ka një efekt të rëndësishëm në biodegradimin e PAH-ve. Ndërsa temperatura rritet, përqendrimi i oksigjenit të tretur zvogëlohet, gjë që ndikon në metabolizmin e mikroorganizmave aerobë, pasi ato kërkojnë oksigjen molekular si një nga substratet për oksigjenazat që kryejnë reaksione hidroksilimi ose copëtimi të unazës. Shpesh vihet re se temperatura e lartë i shndërron PAH-të mëmë në komponime më toksike, duke penguar kështu biodegradimin (Muller et al., 1998).
Është vënë re se shumë vende të kontaminuara me PAH kanë vlera ekstreme të pH-it, siç janë vendet e kontaminuara me kullim acid të minierave (pH 1-4) dhe vendet e gazifikimit të gazit natyror/qymyrit të kontaminuara me rrjedhje alkaline (pH 8-12). Këto kushte mund të ndikojnë seriozisht në procesin e biodegradimit. Prandaj, para se të përdorni mikroorganizma për bioremediation, rekomandohet të rregulloni pH-in duke shtuar kimikate të përshtatshme (me potencial të moderuar deri në shumë të ulët të oksido-reduktimit) siç është sulfati i amonit ose nitrat amoni për tokat alkaline ose gëlqerëzimi me karbonat kalciumi ose karbonat magnezi për vendet acidike (Bowlen et al. 1995; Gupta dhe Sar 2020).
Furnizimi me oksigjen në zonën e prekur është faktori kufizues i shpejtësisë për biodegradimin e PAH-ve. Për shkak të kushteve redoks të mjedisit, proceset e bioremediation in situ zakonisht kërkojnë futjen e oksigjenit nga burime të jashtme (lëvrim, spërkatje me ajër dhe shtim kimik) (Pardieck et al., 1992). Odenkranz et al. (1996) treguan se shtimi i peroksidit të magnezit (një përbërës që çliron oksigjen) në një akuifer të kontaminuar mund të bioremediatojë në mënyrë efektive përbërjet BTEX. Një studim tjetër hetoi degradimin in situ të fenolit dhe BTEX në një akuifer të kontaminuar duke injektuar nitrat natriumi dhe duke ndërtuar puse nxjerrjeje për të arritur bioremediation efektiv (Bewley dhe Webb, 2001).