Aktualisht†Adresa aktuale: OX11 0DE, Mbretëria e Bashkuar, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Mbretëria e Bashkuar, Diamond Light Source Co., Ltd., Qendra e Imazherisë Biologjike Elektronike.
Kompleksi 1 i qendrës së reagimit që mbledh dritën (RC-LH1) është përbërësi kryesor fotosintetik i baktereve fototrofe vjollcë. Ne prezantuam dy struktura mikroskopike krio-elektronike të kompleksit RC-LH1 nga Rhodopseudomonas palustris. Struktura me rezolucion 2.65-Å e kompleksit RC-LH114-W përbëhet nga 14 sythe LH1 të nënnjësive që rrethojnë RC, e cila ndërpritet nga proteina W, ndërsa kompleksi pa proteinë-W është plotësisht në përbërjen RC i rrethuar nga RC. Lak LH1 i mbyllur me 16 nënnjësi. Krahasimi i këtyre strukturave ofron njohuri mbi dinamikën e kinonës në kompleksin RC-LH1, duke përfshirë ndryshimet konformacionale të papërcaktuara më parë kur lidhet kinona në vendin QB të RC, si dhe vendndodhjen e vendeve ndihmëse të lidhjes së kinonës, të cilat ndihmojnë në kalimin e tyre në RC. Struktura unike e proteinës W parandalon mbylljen e lakut LH1, duke krijuar kështu një kanal për përshpejtimin e shkëmbimit kinon/kinolon.
Energjia e siguruar nga fotosinteza mund të mbështesë pothuajse të gjithë jetën në tokë dhe ka potencial të madh për bioteknologjinë diellore. Ndërsa promovojnë fotosintezën globale, bakteret fototrofike vjollcë shfaqin gjithashtu mënyra të ndryshme energjie dhe aftësi metabolike. Ato mund të shmangin fotosintezën dhe të rriten si baktere heterotrofike në errësirë, mund të fiksojnë azotin dhe dioksidin e karbonit, të prodhojnë hidrogjen dhe të degradojnë komponimet aromatike (1-3). Për të siguruar energji për këto procese, drita duhet të shndërrohet shpejt dhe me efikasitet në energji kimike. Ky proces fillon kur kompleksi i antenës që bllokon dritën thith dritën dhe transferon energjinë e bllokuar në qendrën e reagimit (RC), duke filluar kështu ndarjen e ngarkesës (4-7). Njësia bazë e fotosintezës në bakteret fototrofike vjollcë përbëhet nga RC i tipit 2, i rrethuar nga kompleksi 1 që mbledh dritën (LH1), duke formuar kompleksin kryesor RC-LH1. LH1 formohet nga një grup heterodimesh të lakuar αβ, secila prej të cilave lidh dy molekula klorofili bakterial (BChl)a dhe një ose dy karotenoide (8-12). Antena më e thjeshtë LH1 përbëhet nga 16 ose 17 αβ heterodimere që rrethojnë RC (9-13) në një lak të mbyllur, por në komplekse të tjera thelbësore, peptidet transmembranore ndërpresin vazhdimësinë e LH1 përreth, duke nxitur kështu difuzionin kinol/kinon midis RC dhe kompleksit të citokromit bc1 (11, 13-15). Bima fototrofike vjollcë Rhodopseudomonas (Rps.) është një organizëm model që mund të kuptojë transferimin e energjisë dhe elektroneve që mbështet fotosintezën. Struktura e parë kristalore e Rps. Modeli i kompleksit palustris RC-LH1 është RC, i rrethuar nga 15 sythe heterodimere LH1, të cilat ndërpriten nga një proteinë e panjohur e quajtur "Proteina W" (14). Proteina-W u identifikua më pas si RPA4402, e cila është një proteinë e pakarakterizuar 10.5kDa me tre helika transmembranore të parashikuara (TMH) (16). Ne propozojmë të riemërtojmë gjenin rpa4402 që kodon proteinën W në pufW për të qenë në përputhje me nomenklaturën e përdorur për gjenet që kodojnë nënnjësitë RC-L, M (pufL, pufM) dhe LH1α, β (pufA, pufB). Është interesante se proteina-W është e pranishme vetëm në rreth 10% të RC-LH1, duke zbuluar se Rps. palustris prodhon dy komplekse të ndryshme RC-LH1. Këtu, ne raportojmë strukturat krio-EM (krio-EM) me rezolucion të lartë të dy komplekseve kryesore, njëri me proteinën W dhe 14 heterodimerë αβ, tjetri pa proteinën W dhe një lak të mbyllur LH1 me 16 heterodimerë. Struktura jonë përfaqëson një ndryshim hap pas hapi në kuptimin e kompleksit RC-LH1 të Rps. palustris, sepse kemi analizuar popullatën homogjene të secilit variant dhe kemi rezolucion të mjaftueshëm për të caktuar qartë çdo peptid dhe pigmente të lidhura dhe lipide dhe kinone të lidhura. Krahasimi i këtyre strukturave tregon se tre proteinat TMH-W që nuk janë gjetur në asnjë kompleks tjetër RC-LH1 deri më tani gjenerojnë një kanal kinone për të përshpejtuar shkëmbimin kinon/kinolon. Janë identifikuar një numër vendesh të konservuara të lidhjes së lipideve dhe kinoneve, dhe ne kemi zbuluar një ndryshim të ri konformacional pas kombinimit të kinonës dhe RC, i cili mund të jetë i përshtatshëm për RC të fotosistemit II (PSII) të organizmave fototrofikë të oksigjenuar. Gjetjet tona ofrojnë njohuri të reja mbi kinetikën e lidhjes dhe shkëmbimit të kinonës/kinolonit në kompleksin kryesor RC-LH1 të baktereve fototrofike vjollcë.
Për të lehtësuar një studim të detajuar të dy komplekseve të gjetura në Rps. palustris, ne izolojmë secilin RC-LH1 me anë të metodave biokimike. Kompleksi me mungesë të proteinës W (në tekstin e mëtejmë ΔpufW) u pastrua nga lloji që i mungon gjeni pufW (16), dhe vetëm një kompleks RC-LH1 mund të prodhohet. Kompleksi që përmban proteinën W prodhohet nga një lloj. Proteina W e këtij lloji modifikohet me një etiketë 10x His në skajin e saj C, në mënyrë që kompleksi që përmban proteinën W të mund të kombinohet në mënyrë efektive me shumicën e proteinave që mungojnë W duke imobilizuar metalin. Kompleksi ndahet në mënyrë efektive (16) Kromatografia e Afinitetit (IMAC).
Siç tregohet në Figurën 1, të dy komplekset përmbajnë një RC me tre nën-njësi (RC-L, RC-M dhe RC-H) të rrethuar nga një antenë LH1. Struktura 2.80-A e kompleksit që nuk ka proteinë-W tregon 16 αβ heterodimere, duke formuar një lak të mbyllur LH1 që rrethon plotësisht RC, që më poshtë do të quhet kompleksi RC-LH116. Struktura 2.65 Å e kompleksit që përmban proteinë-W ka një LH1 14-heterodimer të ndërprerë nga proteina-W, që më poshtë do të quhet RC-LH114-W.
(A dhe B) Përfaqësimi sipërfaqësor i përbërjes. (C dhe D) Pigmente të lidhura të shprehura në shufra. (E dhe F) Komplekset e vëzhguara nga sipërfaqja citoplazmatike kanë peptidet dhe nënnjësitë LH1 të përfaqësuara në karikatura, dhe janë të numëruara në drejtim të akrepave të orës nga boshllëku proteinë-W [në përputhje me numërimin Rba. kompleksi sphaeroides (13)]. Për LH1-α, ngjyra e nënnjësisë së proteinave është e verdhë; për LH1-β, ngjyra e nënnjësisë së proteinave është blu; për proteinën-W, proteina është e kuqe; për RC-H, është cian; për RC-L, është portokalli; për RC-M, magenta. Kofaktorët përfaqësohen nga shufra, jeshile përfaqëson molekulat BChl dhe BPha, vjollcë përfaqëson karotenoidet, dhe e verdha përfaqëson molekulat UQ10. (G dhe H) Pamje e zmadhuar e boshllëkut proteinë-W në rajonin ekuivalent të kompleksit RC-LH114-W (G) dhe kompleksit RC-LH116 (H). Kofaktorët shfaqen në formën e mbushjes së hapësirës, ​​kinoni i kelatuar shfaqet me ngjyrë blu. Hapësira proteinë-W është e theksuar nga një vijë e ndërprerë blu në (G), dhe vrimat e vogla ku kinoni/kinololi shpërndahet në unazën LH116 janë të theksuara nga një vijë e ndërprerë e zezë në (H).
Figura 1 (A dhe B) tregon RC të rrethuar nga vargje të hapura ose të mbyllura të heterodimerëve LH1αβ, secili prej të cilëve lidhet me dy BChl dhe një karotenoid (Figura 1, C dhe D). Studimet e mëparshme kanë treguar se Rps është kompleksi LH1. Në rrugën biosintetike të ksantinës së spirulinës, këto specie përmbajnë popullata të përziera të karotenoideve (17). Megjithatë, spiropiroksantina është karotenoidi dominues dhe dendësia e saj është e kënaqshme. Prandaj, ne zgjodhëm të modelojmë spiroksantinën në të gjitha vendet e lidhjes së LH1. Polipeptidet alfa dhe beta janë TMH të vetme me rajone të shkurtra të membranës së jashtme (Figura 1, A, B, E dhe F). Megjithëse dendësia e 17 mbetjeve në skajin C nuk u vu re, polipeptidi alfa u nda nga Met1 në Ala46 në të dy komplekset. Polipeptidi β u reduktua nga Gly4 në Tyr52 në RC-LH116 dhe nga Ser5 në Tyr52 në RC-LH114-W. Nuk u vu re dendësi prej 3 ose 4 mbetjesh N-terminale ose 13 C-terminale (Figura S1). Analiza e spektrometrisë masive e kompleksit të përzier RC-LH1 të përgatitur nga lloji i egër tregoi se rajoni që mungonte ishte rezultat i copëtimit heterolog të këtyre peptideve (Figura S1 dhe S2). Formimi N-terminal i α-Met1 u vu re gjithashtu (f). Analiza tregoi se α-peptidi përbëhet nga mbetjet fMet1 deri në Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, dhe β-peptidi përbëhet nga mbetjet Ser2 deri në Ala53, gjë që është në përputhje të mirë me hartën e dendësisë EM në temperaturë të ulët.
Koordinimi i α-His29 dhe β-His36 i bën BChl-të ballë për ballë; çdo heterodimer αβ bashkohet me fqinjët e tij për të formuar një lak të hapur (RC-LH114-W) ose një lak të mbyllur (RC-LH116) rreth RC. Matrica e pigmenteve të çiftëzuara me eksiton (Figura 1, C dhe D). Krahasuar me brezin 877 nm të RC-LH114-W, zhvendosja e kuqe e absorbimit prej 880 nm e RC-LH116 është 3 nm (Figura 2A). Megjithatë, spektri i dikroizmit rrethor është pothuajse i njëjtë (Figura 2B), duke treguar se megjithëse ekziston një ndryshim i qartë midis lakeve të hapura dhe të mbyllura, mjedisi lokal i BChl-ve është shumë i ngjashëm. Zhvendosja e kuqe e absorbimit mund të jetë rezultat i lëvizjes termike të zvogëluar dhe stabilitetit të rritur në lak të mbyllur (18, 19), ndryshimit në çiftëzimin e pigmenteve të shkaktuar nga lak i mbyllur (20, 21), ose një kombinim i këtyre dy efekteve (11).
(A) Spektri i absorbimit ultravjollcë/i dukshëm/afër infra të kuqe, majat e të cilave janë shënuar me pigmentet e tyre përkatëse dhe normalizuar në majën BPh në 775 nm. (B) Spektri i dikroizmit rrethor i normalizuar në absorbimin BChl në 805 nm. (C dhe D) Spektrat e zgjedhur ΔA nga spektrat e absorbimit me zgjidhje kohore të kompleksit RC-LH114-W (C) dhe kompleksit RC-LH116 (D). Për krahasim më të mirë, të gjitha spektrat janë normalizuar në ΔA të −A në 0.2 ps. (E) Shkalla e oksidimit të citokromit c2 pas rrezatimit në prani të përqendrimeve të ndryshme të UQ2 (shih Figurën S8 për të dhëna të papërpunuara). (F) Në qelizat e rritura nën dritë me intensitet të ulët, të mesëm ose të lartë (përkatësisht 10, 30 ose 300μMm-2 s-1), nënnjësitë e proteinave W dhe RC-L në kompleksin e pastruar dhe raporti i membranës së ndarë. Përcaktoni nivelin e proteinave me anë të elektroforezës dhe imunotestit në xhel SDS-poliakrilamid (shih Figurën S9 për të dhëna të papërpunuara). Përcaktoni raportin në lidhje me kompleksin e pastruar RC-LH114-W. Raporti stekiometrik i RC-L me proteinën-W të kompleksit është 1:1.
BChl-et në pozicionin 1 në lakun e deformuar αβ14 të RC-LH114-W (Figura 1, A, C dhe E) janë më afër donatorit primar të RC (P) me 6.8 Å sesa BChl-et ekuivalente në RC-LH116 (Figura 1, B, D dhe F, dhe Figura S3); megjithatë, kinetika e absorbimit kalimtar të dy komplekseve tregon se për RC-LH114-W dhe RC-LH116, konstantet e kohës së transferimit të energjisë së ngacmimit nga LH1 në RC janë 40 ± 4 dhe 44 ± 3 ps (Figura 2). , C dhe D, Figura S4 dhe Tabela S2). Gjithashtu nuk ka ndonjë ndryshim të rëndësishëm në transferimin elektronik brenda RC (Figura S5 dhe teksti plotësues përkatës). Ne dyshojmë se korrespondenca e ngushtë e kohës së transferimit të energjisë midis LH1 dhe RC-P është për shkak të distancës, këndit dhe energjisë potenciale të ngjashme të shumicës së BChl në dy laqet LH1. Duket se eksplorimi i modelit të energjisë LH1 për të arritur distancën minimale nuk është më i shpejtë se transferimi i drejtpërdrejtë i energjisë nga vendet jo optimale në RC. Laku LH1 me lak të hapur në RC-LH114-W mund të pësojë gjithashtu lëvizje termike të parëndësishme në kushte të temperaturës së ulët për analizën strukturore, dhe ka një konformacion më të gjatë të unazës αβ14 në temperaturën e dhomës nga distanca e pigmentimit të βBChls në pozicionin e RC 1.
Kompleksi RC-LH116 përmban 32 BChl dhe 16 karotenoide, dhe rregullimi i tij i përgjithshëm është i njëjtë me atë të marrë nga Thermochromatium (Tch.) piddipudum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), lloji Thiorhodovibrio (Trv.) 970 (PDB ID 7C9R) (12) dhe algat e gjelbra (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Pas shtrirjes, u vunë re vetëm devijime të vogla në pozicionet e heterodimerëve αβ, veçanërisht 1-5, 15 dhe 16 (Figura S6). Prania e proteinës-W ka një ndikim të rëndësishëm në strukturën e LH1. Tre TMH-të e saj janë të lidhura me sythe të shkurtra, me N-terminalin në anën e lumenit të kompleksit dhe C-terminalin në anën citoplazmike (Figurat 1A dhe 3, A deri në D). Proteina-W është kryesisht hidrofobe (Figura 3B), dhe TMH2 dhe TMH3 bashkëveprojnë me LH1αβ-14 për të formuar një sipërfaqe transmembranore (Figura 3, B dhe E deri në G). Ndërfaqja përbëhet kryesisht nga mbetjet Phe, Leu dhe Val në rajonin transmembranor. Këto mbetje janë të grumbulluara me aminoacide hidrofobe dhe pigmente αβ-14. Disa mbetje polare gjithashtu kontribuojnë në bashkëveprim, duke përfshirë lidhjen e hidrogjenit midis W-Thr68 dhe β-Trp42 në sipërfaqen e zgavrës komplekse (Figura 3, F dhe G). Në sipërfaqen e citoplazmës, Gln34 është ngjitur me grupin keto të karotenoideve αβ-14. Përveç kësaj, molekula n-dodecil β-d-maltozid (β-DDM) u zgjidh, dhe bishti i saj hidrofobik u shtri në ndërfaqen midis proteinës-W dhe αβ-14, dhe bishti lipidik mund të jetë i vendosur në trup. Gjithashtu vumë re se rajonet e rezolucionit C-terminal të proteinës W dhe RCH janë shumë afër, por jo brenda fushëveprimit të formimit të ndërveprimeve specifike (Figura 1, A dhe E). Megjithatë, mund të ketë ndërveprime në aminoacidet e pazgjidhura C-terminale të këtyre dy proteinave, të cilat mund të ofrojnë një mekanizëm për rekrutimin e proteinës-W gjatë montimit të kompleksit RC-LH114-W.
(A) Proteina-W, e cila është përballë ndërfaqes me LH1αβ14 në formë vizatimi, ka një zinxhir anësor në formë shufre (të kuqe), të shfaqur në një pjesë të diagramit të potencialit elektrostatik (sipërfaqe gri transparente me një nivel konturi prej 0.13). (B) Proteina-W e përfaqësuar nga një sipërfaqe me ngjyrë hidrofobe. Zonat polare dhe të ngarkuara shfaqen në ngjyrë cian, zonat hidrofobe shfaqen në të bardhë, dhe zonat fort hidrofobe shfaqen në ngjyrë portokalli. (C dhe D) Proteina-W e përfaqësuar në formë vizatimi, orientimi i saj është i njëjtë si në (A) (C), dhe e rrotulluar me 180° (D). Sipas pozicionit në sekuencë, mbetjet e dallueshme marrin një skemë ngjyrash ylberi, ku N-terminali është blu dhe C-terminali është i kuq. (E) Proteina-W në të njëjtën pamje si në (A), dhe mbetjet në ndërfaqen e proteinës-W:LH1 përfaqësohen nga shufra me shenja të bashkangjitura. (F) Proteina-W është rrotulluar 90° në krahasim me (E) dhe LH1αβ14 në paraqitjen vizatimore, dhe në krahasim me mbetjet e ndërfaqes në paraqitjen me shirita. Mbetjet e mbivendosura nga polipeptidi beta janë të etiketuara. Kofaktori tregohet si një shirit që përputhet me ngjyrën e Figurës 1, β-DDM i zbërthyer tregohet me gri, dhe oksigjeni tregohet me të kuqe. (G) Pamja në (F) është rrotulluar 180°, me mbetjet e spikatura të polipeptidit alfa të etiketuar.
Proteina-W zëvendëson një heterodimer αβ (i 15-ti në Figurën 1F), duke parandaluar kështu mbylljen e lakut dhe animin e tre heterodimerëve të parë αβ. U vu re se këndi maksimal i pjerrësisë së heterodimerit të parë αβ-1 në krahasim me normalen e filmit ishte 25° deri në 29° (Figura 1, A dhe E), i cili u formua nga pjerrësia 2° deri në 8° e αβ-1 në RC A me kontrast të mprehtë-LH116 (Figura 1, B dhe F). Heterodimerët e dytë dhe të tretë janë të pjerrët në 12° deri në 22° dhe 5° deri në 10°, përkatësisht. Për shkak të pengesës sterike të RC, pjerrësia e αβ-1 nuk përfshin çiftin e dytë të αβ (që korrespondon me αβ të 16-të në Figurën 1F), duke formuar kështu një boshllëk të qartë në unazën LH1 (Figura 1, A dhe E). Për shkak të mungesës së dy heterodimerëve αβ, të shoqëruar me humbjen e katër BChl dhe dy karotenoideve, asnjë nga karotenoidet nuk lidhet me nën-njësinë e përdredhur αβ-1, duke rezultuar në një unazë LH114-W që përmban 13 karotenoide vegjetariane dhe 28 BChl. Vlerësimet e rezolucionit lokal të dy komplekseve në rajonet αβ1 deri në 7 janë më të ulëta se ato të pjesës tjetër të lakut LH1, gjë që mund të pasqyrojë plasticitetin e natyrshëm të nën-njësisë LH1 ngjitur me vendin RC QB (Figura 4).
Fotografitë e RC-LH114-W (A dhe B) dhe RC-LH116 (C dhe D) tregohen nga e njëjta pamje nga lart/pamje anësore (A dhe B) (A dhe C) dhe sipërfaqja e zgavrës së Fig. 1. (B dhe D). Çelësat me ngjyra tregohen në të djathtë.
I vetmi kompleks tjetër karakteristik i bërthamës me një raport stekiometrik prej 1:14 është dimeri RC-LH1-PufX i Rhodococcus sphaeroides (Rba.) (13). Megjithatë, proteina W dhe PufX nuk kanë homologji të dukshme dhe kanë një ndikim të rëndësishëm në strukturat e tyre përkatëse LH1. PufX është një TMH i vetëm me një domen citoplazmatik N-terminal që bashkëvepron me anën citoplazmike të nënnjësisë RC-H (13) në një pozicion që korrespondon me Rps. palustris LH116αβ-16. PufX krijon një kanal për shkëmbimin kinon/kinolon midis RC-LH1 dhe kompleksit të citokromit bcl dhe është i pranishëm në të gjithë kompleksin bërthamë Rba. sphaeroides (13). Megjithëse ndërfaqja monomer-monomer është në Rba. Dimeri sphaeroides RC-LH1-PufX ndodhet në pozicionin e lidhjes së proteinës W në RC-LH114-W, dhe boshllëku i shkaktuar nga PufX dhe proteina-W është në një pozicion ekuivalent (Figura S7A). Boshllëku në RC-LH114-W është gjithashtu i lidhur me kanalin hipotetik të kinonës (8) të Pseudomonas rosea LH1, i cili formohet nga peptide që nuk lidhen me proteinën W ose PufX (Figura S7B). Përveç kësaj, kanali i kinonës në Blc. LH1 me ngjyrë smeraldi i formuar duke përjashtuar një nënnjësi γ (7) ndodhet në një pozicion të ngjashëm (Figura S7C). Megjithëse ndërmjetësohet nga proteina të ndryshme, shfaqja e këtyre kanaleve të kinonës/kinololit në një pozicion të përbashkët në kompleksin RC-LH1 duket të jetë një shembull i evolucionit konvergjent, duke treguar se boshllëku i krijuar nga proteina W mund të veprojë si një kanal i kinonës.
Hapësira në lakun LH114-W lejon formimin e një rajoni të vazhdueshëm membranor midis hapësirës së brendshme të kompleksit RC-LH114-W dhe membranës kryesore (Figura 1G), në vend që të lidhë dy domenet përmes një pore proteine ​​si në proteina. Kompleksi RC-LH116 është i ngjashëm me një kompleks të mbyllur Tch. në formë gjilpëre (22) (Figura 1H). Meqenëse difuzioni i kinonës përmes membranës është më i shpejtë se difuzioni përmes kanalit të ngushtë të proteinave, laku i hapur LH114-W mund të lejojë një qarkullim më të shpejtë të RC sesa laku i mbyllur LH116, dhe difuzioni i kinonës në RC mund të jetë më i kufizuar. Për të testuar nëse proteina W ndikon në konvertimin e kinoneve përmes RC, ne kryem një analizë oksidimi të citokromit në një përqendrim të caktuar të ubikinonës 2 (UQ2) (një analog i UQ10 natyral me një bisht më të shkurtër izopreni) (Figura 2E). Edhe pse prania e kinonit të kelatuar pengon përcaktimin e saktë të konstantës së dukshme Michaelis (RC-LH114-W dhe RC-LH116 janë të përshtatshëm për 0.2 ± 0.1μM dhe 0.5 ± 0.2μM, përkatësisht), shkalla maksimale e RC-LH114-W (4.6 ± 0.2 e-RC-1 s-1) është 28 ± 5% më e madhe se RC-LH116 (3.6 ± 0.1 e-RC-1 s-1).
Fillimisht vlerësuam se proteina-W është e pranishme në rreth 10% të kompleksit bazë (16); këtu, shkallët e okupimit të qelizave të rritjes në dritë të ulët, dritë mesatare dhe dritë të lartë janë përkatësisht 15±0.6%, 11±1% dhe 0.9±0.5% (Figura 2F). Krahasimi sasior i spektrometrisë masive tregoi se shtimi i etiketës së histidinës nuk e uli bollëkun relativ të proteinës-W krahasuar me llojet e tipit të egër (P = 0.59), kështu që këto nivele nuk janë një artefakt i proteinës-W të modifikuar (Figura S10). Megjithatë, kjo okupim i ulët i proteinës-W në kompleksin RC-LH1 mund të lejojë që disa RC të ndërrohen me një shpejtësi të përshpejtuar, duke zbutur kështu shkëmbimin më të ngadaltë të kinonës/kinolonit në kompleksin RC-LH116. Vumë re se shkalla e lartë e okupimit të dritës është e papajtueshme me të dhënat e fundit të transkriptomikës, gjë që tregon se shprehja e gjenit pufW rritet nën dritë të fortë (Figura S11) (23). Dallimi midis transkriptimit të pufW dhe inkorporimit të proteinës-W në kompleksin RC-LH1 është konfuz dhe mund të pasqyrojë rregullimin kompleks të proteinës.
Në RC-LH114-W, 6 kardiolipina (CDL), 7 fosfatidilkolinë (POPC), 1 fosfatidilglicerol (POPG) dhe 29 molekula β-DDM janë të alokuara dhe modeluara në të 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG dhe 12 βDDM. RC-LH116 (Figura 5, A dhe B). Në këto dy struktura, CDL është pothuajse e vendosur në anën citoplazmike të kompleksit, ndërsa POPC, POPG dhe β-DDM janë kryesisht të vendosura në anën luminale. Dy molekula lipidesh dhe detergjentësh u izoluan në rajonin αβ-1 deri në αβ-6 të kompleksit RC-LH114-W (Figura 5A), dhe pesë u izoluan në rajonin ekuivalent të RC-LH116 (Figura 5B). Më shumë lipide u gjetën në anën tjetër të kompleksit, kryesisht CDL, të grumbulluara midis RC dhe αβ-7 deri në αβ-13 (Figura 5, A dhe B). Lipide dhe detergjentë të tjerë të zgjidhur strukturorisht ndodhen jashtë unazës LH1, dhe zinxhirët acil të zgjidhur mirë shtrihen midis nënnjësive LH1, të përcaktuara paraprakisht si β-DDM në RC-LH114-W, dhe të përcaktuara si β-DDM në RC. Një përzierje e β-DDM dhe POPC-LH116. Pozicionet e ngjashme të lipideve dhe detergjentëve kelues në strukturën tonë tregojnë se ato janë vende lidhëse fiziologjikisht të rëndësishme (Figura S12A). Pozicionet e molekulave ekuivalente në Tch gjithashtu kanë qëndrueshmëri të mirë. Gentle dhe Trv. Shtami 970 RC-LH1s (Figura S12, B deri në E) (9, 12) dhe mbetjet e lidhjes hidrogjenore të grupit të kokës së lipideve treguan ruajtje mjaft të mirë në shtrirjen e sekuencës (Figura S13), duke treguar se CDL e ruajtur që lidhet me RC (24), këto vende mund të jenë të ruajtura në kompleksin RC-LH1.
(A dhe B) Peptidet RC-LH114-W (A) dhe RC-LH116 (B) përfaqësohen nga vizatime, dhe pigmentet përfaqësohen nga shufra, duke përdorur skemën e ngjyrave në Figurën 1. Lipidet tregohen me të kuqe, dhe detergjentët tregohen me gri. UQ e lidhur me vendet RC QA dhe QB është e verdhë, ndërsa UQ e izoluar është blu. (C dhe D) Të njëjtat pamje si (A) dhe (B), me lipidet e hequra. (E deri në G) Pamje e zmadhuar e Q1(E), Q2(F) dhe Q3(G) nga RC-LH116, me zinxhirë anësorë që ndikojnë njëri-tjetrin. Lidhjet hidrogjenore tregohen si vija të zeza me pika.
Në RC-LH116, si RC QA ashtu edhe QB UQ, të cilat marrin pjesë në transferimin e elektroneve në procesin e ndarjes së ngarkesës, zbërthehen në vendet e tyre të lidhjes. Megjithatë, në RC-LH114-W, QB kinoni nuk është zgjidhur dhe do të diskutohet në detaje më poshtë. Përveç QA dhe QB kinoneve, dy molekula UQ të keluara (të vendosura midis unazave RC dhe LH1) janë të ndara në strukturën RC-LH114-W sipas grupeve të tyre të kokës të zgjidhura mirë (të vendosura në Q1 dhe Q2, përkatësisht). hapësirë). Figura 5C). Dy njësi izopreni i janë caktuar Q1, dhe harta e dendësisë zgjidh 10 bishtat e plotë të izoprenit të Q2. Në strukturën e RC-LH116, tre molekula UQ10 të keluara (Q1 deri në Q3, Figura 5D) u zgjidhën, dhe të gjitha molekulat kanë një dendësi të qartë në të gjithë bishtin (Figura 5, D deri në G). Në të dy strukturat, pozicionet e grupeve kryesore të kinoneve të Q1 dhe Q2 kanë qëndrueshmëri të shkëlqyer (Figura S12F), dhe ato bashkëveprojnë vetëm me RC. Q1 ndodhet në hyrje të boshllëkut W të RC-LH114-W (Figura 1G dhe 5, C, D dhe E), dhe Q2 ndodhet pranë vendit të lidhjes QB (Figura 5, C, D) dhe F). Mbetjet e konservuara L-Trp143 dhe L-Trp269 janë shumë afër Q1 dhe Q2 dhe ofrojnë ndërveprime të mundshme π-stacking (Figura 5, E dhe F, dhe Figura S12). L-Gln88, 3.0 Å nga oksigjeni distal i Q1, siguron një lidhje të fortë hidrogjeni (Figura 5E); kjo mbetje është e konservuar në të gjitha RC-të përveç marrëdhënies më të largët (Figura S13). L-Ser91 zëvendësohet në mënyrë konservative për Thr në shumicën e RC-ve të tjera (Figura S13), është 3.8 Angstrom nga oksigjeni metil i Q1, dhe mund të ofrojë lidhje të dobëta hidrogjeni (Figura 5E). Q3 nuk duket se ka një bashkëveprim specifik, por ndodhet në rajonin hidrofobik midis nënnjësisë RC-M dhe nënnjësisë LH1-α 5 deri në 6 (Figura 5, D dhe G). Q1, Q2 dhe Q3 ose kinonet e kelatuara aty pranë janë zgjidhur gjithashtu në Tch. Gentle, Trv. Strain 970 dhe Blc. Struktura e irisit (9, 10, 12) tregon një vend të ruajtur ndihmës të lidhjes së kinonës në kompleksin RC-LH1 (Figura S12G). Pesë UQ-të e dekompozuara në RC-LH116 janë në përputhje të mirë me 5.8±0.7 të secilit kompleks të përcaktuar nga kromatografia e lëngshme me performancë të lartë (HPLC), ndërsa tre UQ-të e dekompozuara në RC-LH114-W janë më të ulëta se Vlera e matur prej 6.2±0.3 (Fig. S14) tregon se ka molekula UQ të pazgjidhura në strukturë.
Polipeptidet pseudo-simetrike L dhe M përmbajnë secili pesë TMH dhe formojnë një heterodimer që kombinon një dimer BChl, dy monomere BChl, dy monomere bakteriofage (BPh) dhe një hekur jo-hem dhe një ose dy molekula UQ10. Përmes pranisë së lidhjeve hidrogjenore në grupin keton terminal dhe akumulimit të tij të njohur në Rps, karotenoidet përfshihen në nën-njësinë M, e cila quhet cis-3,4-dehidroorhodopinë. Speciet (25). Domeni i membranës së jashtme të RC-H është i ankoruar në membranë nga një TMH i vetëm. Struktura e përgjithshme e RC është e ngjashme me tre nën-njësitë RC të specieve të lidhura (siç është Rba). sphaeroides (ID e PDB: 3I4D). Makrociklet e BChl dhe BPh, shtylla kurrizore e karotenoidit dhe hekuri jo-hem mbivendosen brenda diapazonit të rezolucionit të këtyre strukturave, ashtu si grupi kryesor UQ10 në vendin QA dhe kinoni QB në RC-LH116 (Figura S15).
Disponueshmëria e dy strukturave RC me shkallë të ndryshme të pushtimit të vendit QB ofron një mundësi të re për të shqyrtuar ndryshimet konformacionale të qëndrueshme që shoqërojnë lidhjen e kinonës QB. Në kompleksin RC-LH116, kinona QB ndodhet në pozicionin "proksimal" të lidhur plotësisht (26), por ndarja e RC-LH114-W nuk ka kinonë QB. Nuk ka kinonë QB në RC-LH114-W, gjë që është e habitshme sepse kompleksi është aktiv, më shumë sesa kompleksi RC-LH116 me kinonën QB të zgjidhur strukturorisht. Megjithëse dy unazat LH1 kelatojnë rreth gjashtë kinone, pesë janë të zgjidhura strukturorisht në unazën e mbyllur RC-LH116, ndërsa vetëm tre janë të kufizuara strukturorisht në unazën e hapur RC-LH114-W. Ky çrregullim strukturor i rritur mund të pasqyrojë zëvendësimin më të shpejtë të vendeve QB RC-LH114-W, kinetikën më të shpejtë të kinonës në kompleks dhe rritjen e gjasave të kalimit të lakut LH1. Ne sugjerojmë që mungesa e UQ në vendin RC QB të RC-LH114-W mund të jetë rezultat i një kompleksi më kompleks dhe më aktiv, dhe vendi QB i RC-LH114-W është ngrirë menjëherë në qarkullimin e UQ. Faza specifike (hyrja në vendin QB është mbyllur) pasqyron konformimin e këtij aktiviteti.
Pa QB, rrotullimi shoqërues i L-Phe217 në një pozicion që është i papajtueshëm me lidhjen e UQ10, sepse do të shkaktojë një përplasje hapësinore me njësinë e parë izoprene të bishtit (Figura 6A). Përveç kësaj, ndryshimet kryesore konformacionale të dukshme janë të dukshme, veçanërisht helika de (helika e shkurtër në lakun midis TMH D dhe E) ku L-Phe217 zhvendoset në xhepin e lidhjes QB dhe rrotullimi i L-Tyr223 (Figura 6A) për të thyer lidhjen e hidrogjenit me kornizën M-Asp45 dhe për të mbyllur hyrjen e vendit të lidhjes QB (Figura 6B). Helika de rrotullohet në bazën e saj, Cα e L-Ser209 zhvendoset me 0.33 Å, ndërsa L-Val221Cα zhvendoset me 3.52 Å. Nuk ka ndryshime të dukshme në TMH D dhe E, të cilat janë të mbivendosura në të dy strukturat (Figura 6A). Për aq sa dimë, kjo është struktura e parë në RC natyrore që mbyll vendin QB. Një krahasim me strukturën e plotë (të lidhur me QB) tregon se përpara se kinoni të reduktohet, kërkohet një ndryshim konformacional për ta bërë atë të hyjë në kinon. L-Phe217 rrotullohet për të formuar një bashkëveprim π-stacking me grupin kryesor të kinonit, dhe helika zhvendoset nga jashtë, duke lejuar që skeleti i L-Gly222 dhe zinxhiri anësor i L-Tyr223 të formojnë një rrjet lidhjesh hidrogjeni me një strukturë të qëndrueshme të lidhjes hidrogjeni (Figura 6, A dhe C).
(A) Vizatim mbivendosës i hologramit (zinxhir L, portokalli/zinxhir M, magenta) dhe strukturës apo (gri), në të cilën mbetjet kryesore shfaqen në formën e një përfaqësimi në formë shufre. UQ10 përfaqësohet nga një shirit i verdhë. Vija me pika tregon lidhjet hidrogjenore të formuara në të gjithë strukturën. (B dhe C) Përfaqësimi sipërfaqësor i apolipoproteinës dhe i të gjithë strukturës së unazës, duke nxjerrë në pah oksigjenin e zinxhirit anësor të L-Phe217 me blu dhe L-Tyr223 me të kuqe, përkatësisht. Nën-njësia L është portokalli; nën-njësitë M dhe H nuk janë të ngjyrosura. (D dhe E) Apolipoproteina (D) dhe të gjitha vendet (E) të RC QB [ngjyrosni sipas (A) përkatësisht] dhe Thermophilus thermophilus PSII (jeshile, blu me kinon plastik; PDB ID: 3WU2) Align (58).
Papritur, megjithëse janë të disponueshme disa struktura të RC-ve me mungesë QB pa LH1, ndryshimet konformacionale të vërejtura në këtë studim nuk janë raportuar më parë. Këto përfshijnë strukturën e varfërimit të QB nga Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) dhe Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), të cilat janë pothuajse të njëjta me strukturën e tyre të përgjithshme QB. Një inspektim i afërt i 3PRC zbuloi se molekulat e detergjentit LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) lidhen në hyrje të pozicionit QB, gjë që mund të parandalojë rirregullimin në një konformacion të mbyllur. Megjithëse LDAO nuk zbërthehet në të njëjtin pozicion në 1EYS ose 1OGV, këto RC përgatiten duke përdorur të njëjtin detergjent dhe për këtë arsye mund të prodhojnë të njëjtin efekt. Struktura kristalore e Rba. Sphaeroides RC i bashkëkristalizuar me citokromin c2 (PDB ID: 1L9B) gjithashtu duket se ka një vend të mbyllur QB. Megjithatë, në këtë rast, rajoni N-terminal i polipeptidit RC-M (që bashkëvepron me vendin e lidhjes QB përmes lidhjes H të mbetjes Tyr në helikën Q) merr një konformacion të panatyrshëm, dhe ndryshimi konformacional i QB nuk është eksploruar më tej (30). Ajo që është qetësuese është se nuk e kemi parë këtë lloj deformimi të polipeptidit M në strukturën RC-LH114-W, e cila është pothuajse e njëjtë me rajonin N-terminal të RC-LH116. Duhet gjithashtu të theksohet se pas zhdukjes së antenës LH1 me bazë detergjenti, RC-të apolipoproteinë në PDB u zgjidhën, gjë që eliminoi rezervat e brendshme të kinonit dhe lipidet në boshllëkun midis RC dhe sipërfaqes së brendshme të unazës LH1 përreth (31, 32). RC mbetet funksional sepse ruan të gjithë kofaktorët, përveç kinonit QB të zbërthyeshëm, i cili është më pak i qëndrueshëm dhe shpesh humbet gjatë procesit të përgatitjes (33). Përveç kësaj, dihet që heqja e LH1 dhe lipideve ciklike natyrore nga RC mund të ketë një ndikim në funksione, të tilla si jetëgjatësia e shkurtuar e gjendjes P+QB të ndarë nga ngarkesa (31, 34, 35). Prandaj, ne spekulojmë se ekzistenca e unazës lokale LH1 që rrethon RC mund të ruajë vendin e "mbyllur" të QB, duke ruajtur kështu mjedisin lokal pranë QB.
Edhe pse apolipoproteina (pa kinonën QB) dhe struktura e plotë përfaqësojnë vetëm dy pamje të qarkullimit të vendit QB, në vend të një serie ngjarjesh, ka indikacione se lidhja mund të kufizohet për të parandaluar rilidhjen nga hidrokinona për të penguar frenimin e substratit. Ndërveprimi i kinololit dhe kinonës pranë vendit QB të apolipoproteinës mund të jetë i ndryshëm, gjë që çon në refuzimin e saj nga RC. Është propozuar prej kohësh që ndryshimet konformacionale luajnë një rol në lidhjen dhe reduktimin e kinoneve. Aftësia e RC-ve të ngrira për të reduktuar kinonet pas adaptimit në errësirë ​​është e dëmtuar (36); kristalografia me rreze X tregon se ky dëmtim është për shkak të kinoneve QB që janë bllokuar në një konformacion "distal" rreth 4.5 Å nga pozicioni aktiv proksimal (26), 37). Ne sugjerojmë që ky konformacion distal i lidhjes është një pamje e gjendjes së ndërmjetme midis apolipoproteinës dhe strukturës së plotë të unazës, e cila ndjek ndërveprimin fillestar me kinonën dhe hapjen e vendit QB.
RC i tipit II që gjendet në kompleksin PSII të disa baktereve fototrofike dhe cianobaktereve, algave dhe bimëve ka ruajtje strukturore dhe funksionale (38). Rreshtimi strukturor i treguar në Figurën 6 (D dhe E) thekson ngjashmërinë midis RC-ve PSII dhe vendit QB të kompleksit bakterial RC. Ky krahasim ka qenë prej kohësh një model për të studiuar sistemet e lidhura ngushtë të lidhjes dhe reduktimit të kinoneve. Publikimet e mëparshme sugjeruan që ndryshimet konformacionale shoqërohen me reduktimin e kinoneve në PSII (39, 40). Prandaj, duke marrë parasysh ruajtjen evolucionare të RC, ky mekanizëm lidhjeje i pavëzhguar më parë mund të jetë i zbatueshëm edhe për vendin QB të RC PSII në bimët fototrofike të oksigjenuara.
Shtamet Rps ΔpufW (fshirje e paetiketuar e pufW) dhe PufW-His (proteina W e etiketuar me His në terminalin C-terminal 10x e shprehur nga lokusi natyror i pufW). palustris CGA009 u përshkrua në punën tonë të mëparshme (16). Këto shtame dhe prindi i tipit të egër izogjenik u morën nga frigoriferi duke vendosur një numër të vogël qelizash në një pjatë PYE (secila 5 g litër -1) (e ruajtur në LB në -80 °C, që përmban 50% (w/v) proteinë gliceroli, ekstrakt majaje dhe sukcinat) agar [1.5% (w/v)]. Pllaka u inkubua gjatë natës në errësirë ​​në temperaturë ambienti në kushte anaerobe dhe më pas u ndriçua me dritë të bardhë (~50 μmolm-2 s-1) të siguruar nga llambat halogjene OSRAM 116-W (RS Components, UK) për 3 deri në 5 ditë derisa të shfaqej një koloni e vetme. Një koloni e vetme u përdor për të inokuluar 10 ml të mjedisit M22+ (41) të plotësuar me 0.1% (w/v) acide kazamino (në tekstin e mëtejmë të referuara si M22). Kultura u rrit në kushte me oksigjen të ulët në errësirë ​​në 34°C me tundje në 180 rpm për 48 orë, dhe më pas 70 ml e kulturës u inokulua në të njëjtat kushte për 24 orë. Një kulturë gjysmë-aerobe me një vëllim prej 1 ml përdoret për të inokuluar 30 ml të mjedisit M22 në një shishe qelqi transparente universale me kapak vidhos prej 30 ml dhe u rrezatua me agjitacion (~50μmolm-2 s-1) për 48 orë me anë të një shufre sterile magnetike për përzierje. Pastaj 30 ml e kulturës u inokulua me rreth 1 litër kulturë në të njëjtat kushte, e cila më pas u përdor për të inokuluar rreth 9 litra kulturë të ndriçuar në ~200 μmolm-2 s-1 për 72 orë. Qelizat u mblodhën me anë të centrifugimit në 7132 RCF për 30 minuta, u resuspenduan në ~10 ml tris-HCl 20 mM (pH 8.0) dhe u ruajtën në -20°C derisa të nevojiteshin.
Pas shkrirjes, shtoni disa kristale të deoksiribonukleazës I (Merck, UK), lizozimë (Merck, UK) dhe dy tableta frenuese të proteazës së holoenzimës Roche (Merck, UK) në qelizat e resuspenduara. Në një qelizë me presion francez 20,000 psi (Aminco, SHBA), qelizat u copëtuan 8 deri në 12 herë. Pas heqjes së qelizave të pathyera dhe mbetjeve të patretshme me anë të centrifugimit në 18,500 RCF për 15 minuta në 4°C, membrana u precipitua nga lizati i pigmentuar me anë të centrifugimit në 113,000 RCF për 2 orë në 43,000°C. Hidheni fraksionin e tretshëm dhe resuspendoni membranën me ngjyrë në 100 deri në 200 ml tris-HCl 20 mM (pH 8.0) dhe homogjenizoni derisa të mos ketë më agregate të dukshme. Membrana e pezulluar u inkubua në 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, SHBA) që përmbante 2% (w/v) β-DDM për 1 orë në errësirë ​​në 4°C me përzierje të lehtë. Më pas u centrifugua në 70°C për të tretur 150,000 RCF në 4°C për 1 orë për të hequr mbetjet e patretshme.
Membrana tretëse nga lloji ΔpufW u aplikua në një kolonë shkëmbimi jonik DEAE Sepharose prej 50 ml me tre vëllime kolone (CV) të tamponit lidhës [20 mM tris-HCl (pH 8.0) që përmban 0.03% (w/v) β-DDM]. Lani kolonën me dy tampona lidhëse CV dhe më pas lani kolonën me dy tampona lidhëse që përmbajnë 50 mM NaCl. Kompleksi RC-LH116 u eluua me një gradient linear prej 150 deri në 300 mM NaCl (në tamponin lidhës) në 1.75 CV, dhe kompleksi i mbetur lidhës u eluua me një tampon lidhës që përmban 300 mM NaCl në 0.5 CV. Mblidhni spektrin e absorbimit midis 250 dhe 1000 nm, mbajeni fraksionin me raport absorbimi (A880/A280) më të madh se 1 në 880 deri në 280 nm, hollojeni dy herë në tamponin lidhës dhe përdorni të njëjtën procedurë përsëri në kolonën DEAE. Gjatë pastrimit. Holloni fraksionet me raporte A880/A280 më të larta se 1.7 dhe raporte A880/A805 më të larta se 3.0, kryeni raundin e tretë të shkëmbimit jonik dhe mbani fraksionet me raporte A880/A280 më të larta se 2.2 dhe raporte A880/A805 më të larta se 5.0. Kompleksi pjesërisht i pastruar u përqendrua në ~2 ml në një filtër centrifugal Amicon me peshë molekulare 100,000 (MWCO) (Merck, UK) dhe u ngarkua në një kolonë përjashtimi me madhësi Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, SHBA) që përmbante tampon NaCl 200 mM, dhe më pas u elua në të njëjtin tampon me 1.5 CV. Mblidhni spektrat e absorbimit të fraksionit të përjashtimit të madhësisë dhe përqendroni spektrat e absorbimit me raportet A880/A280 mbi raportet 2.4 dhe A880/A805 mbi raportet 5.8 deri në 100 A880, dhe menjëherë përdoreni ato për përgatitjen ose ruajtjen e rrjetës cryo-TEM. Mbajeni në -80°C derisa të jetë e nevojshme.
Membrana tretëse nga lloji PufW-His u aplikua në një kolonë 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose (20 mM tris-HCl (pH 8.0) që përmban 200 mM NaCl dhe 0.03% (p/p)) në tampon IMAC (GE Healthcare). v) β-DDM]. Kolona u la me pesë CV të tamponit IMAC, dhe më pas me pesë CV të tamponit IMAC që përmban 10 mM histidinë. Kompleksi kryesor u elua nga kolona me pesë tampona IMAC që përmbajnë 100 mM histidinë. Fraksioni që përmban kompleksin RC-LH114-W përqendrohet në ~10 ml në një rezervuar të përzier të pajisur me një filtër Amicon 100,000 MWCO (Merck, UK), hollohet 20 herë me tampon lidhës dhe më pas shtohet në 25 ml. Në kolonën DEAE Sepharose, përdoren paraprakisht katër CV të lidhura me tamponin. Lani kolonën me katër tampona lidhëse CV, pastaj eluoni kompleksin në tetë CV në një gradient linear prej 0 deri në 100 mM NaCl (në tamponin lidhës), dhe katër CV-të e mbetura përmbajnë 100 mM tampon lidhës. Komplekset e mbetura të eluuara në klorur natriumi të kombinuara me raportin A880/A280 më të lartë se 2.4 dhe raportin A880/A805 më të lartë se 4.6 fraksione u përqendruan në ~2 ml në një filtër centrifugal Amicon 100,000 MWCO, dhe u mbushën me 1.5 CV IMAC paraprakisht. Tamponi i ekuilibruar Superdex 200 16/600 i ekuilibruar, dhe më pas u eluuan në të njëjtin tampon mbi 1.5 CV. Mblidhni spektrat e absorbimit të fraksioneve të përjashtimit të madhësisë dhe përqendroni spektrat e absorbimit me raporte A880/A280 mbi 2.1 dhe raporte A880/A805 mbi 4.6 deri në 100 A880, të cilat përdoren menjëherë për përgatitjen e rrjetës TEM të ngrirë ose ruhen në -80°C derisa të nevojiten.
Një frigorifer zhytës Leica EM GP u përdor për të përgatitur rrjeta TEM me temperaturë të ulët. Kompleksi u hollua në tampon IMAC në A880 prej 50, dhe më pas 5μl u ngarkuan në një rrjetë bakri të veshur me karbon QUANTIFOIL 1.2/1.3 të sapo shkarkuar me shkëlqim (Agar Scientific, UK). Inkubojeni rrjetën në 20°C dhe 60% lagështi relative për 30 sekonda, pastaj thajeni për 3 sekonda dhe më pas shuajeni në etan të lëngshëm në -176°C.
Të dhënat e kompleksit RC-LH114-W u regjistruan në eBIC (Qendra Elektronike e Bioimazimit) (British Diamond Light Source) me një mikroskop Titan Krios, i cili punon me një tension përshpejtues prej 300kV, me një zmadhim nominal prej 130,000× dhe një energji prej - Zgjidhni një boshllëk prej 20 eV. Një Gatan 968 GIF Quantum me detektor kulmi K2 u përdor për të regjistruar imazhe në modalitetin e numërimit për të mbledhur të dhëna. Madhësia e pikselit të kalibruar është 1.048 Å, dhe shkalla e dozës është 3.83 e-Å-2s-1. Filmi u mblodh në 11 sekonda dhe u nda në 40 pjesë. Përdorni zonën e veshur me karbon për të rifokusuar mikroskopin dhe më pas mblidhni tre filma për vrimë. Në total, u mblodhën 3130 filma, me vlera defokusi midis -1 dhe -3μm.
Të dhënat për kompleksin RC-LH116 u mblodhën duke përdorur të njëjtin mikroskop në Laboratorin Biostrukturor Asterbury (Universiteti i Leeds, Mbretëria e Bashkuar). Të dhënat u mblodhën në modalitetin e numërimit me një zmadhim prej 130 k, dhe madhësia e pikselit u kalibrua në 1.065 Å me një dozë prej 4.6 e-Å-2s-1. Filmi u regjistrua në 12 sekonda dhe u nda në 48 pjesë. Në total, u mblodhën 3359 filma, me vlera defokusi midis -1 dhe -3μm.
I gjithë përpunimi i të dhënave kryhet në tubacionin Relion 3.0 (42). Përdorni Motioncorr 2 (43) për të korrigjuar lëvizjen e rrezes duke peshuar dozën, dhe më pas përdorni CTFFIND 4.1 (44) për të përcaktuar parametrin CTF (funksioni i transferimit të kontrastit). Fotomikrografitë tipike pas këtyre fazave fillestare të përpunimit tregohen në Figurën 2. S16. Shablloni i përzgjedhjes automatike gjenerohet duke zgjedhur manualisht rreth 250 pikselë nga 1000 grimca në një kornizë prej 250 pikselësh dhe pa klasifikim referues dy-dimensional (2D), duke hedhur poshtë kështu ato klasifikime që plotësojnë kontaminimin e mostrës ose nuk kanë karakteristika të dallueshme. Pastaj, përzgjedhja automatike u krye në të gjitha mikrofotografitë, dhe RC-LH114-W ishte 849,359 grimca, dhe kompleksi RC-LH116 ishte 476,547 grimca. Të gjitha grimcat e përzgjedhura i janë nënshtruar dy raundeve të klasifikimit 2D jo-referues, dhe pas çdo përdorimi, grimcat që plotësojnë zonën e karbonit, ndotjen e mostrës, mungesën e karakteristikave të dukshme ose grimcat që mbivendosen fort hidhen poshtë, duke rezultuar në 772,033 (90.9%) dhe 359,678 (75.5%) grimca përdoren për klasifikimin 3D të RC-LH114-W dhe RC-LH116 përkatësisht. Modeli fillestar i referencës 3D u gjenerua duke përdorur metodën stokastike të zbritjes së gradientit. Duke përdorur modelin fillestar si referencë, grimcat e përzgjedhura klasifikohen në katër kategori në 3D. Duke përdorur modelin në këtë kategori si referencë, kryeni rafinim 3D në grimcat në kategorinë më të madhe, pastaj përdorni filtrin fillestar të kalimit të ulët 15 Å për të mbuluar zonën e tretësit, shtoni 6 piksel të skajeve të buta dhe përpunoni më pas pikselët për të korrigjuar funksionin e transferimit të modulimit të majës Gatan K2 të detektorit të sipërm. Për të dhënat RC-LH114-W, ky model fillestar u modifikua duke hequr dendësinë e fortë në skajet e maskës (të shkëputura nga dendësia e kompleksit bazë në UCSF Chimera). Modelet që rezultuan (rezolucionet e RC-LH114-W dhe RC-LH116 janë përkatësisht 3.91 dhe 4.16 Å) përdoren si referencë për raundin e dytë të klasifikimit 3D. Grimcat e përdorura janë grupuar në klasën fillestare 3D dhe nuk përmbajnë korrelacion të fortë me afërsinë. Mbivendosje ose mungesë e karakteristikave të dukshme strukturore. Pas raundit të dytë të klasifikimit 3D, u zgjodh kategoria me rezolucionin më të lartë [Për RC-LH114-W, një kategori është 377,703 grimca (44.5%), për RC-LH116, ka dy kategori, që arrijnë në total 260,752 grimca (54.7%), ku ato janë të njëjta vetëm kur rreshtohen pas rrotullimit fillestar me një ndryshim të vogël]. Grimcat e përzgjedhura ri-nxirren në një kuti me 400 piksel dhe rafinohen me rafinim 3D. Maska e tretësit gjenerohet duke përdorur filtrin fillestar të kalimit të ulët 15 Å, zgjerimin e hartës me 3 piksel dhe maskën e butë me 3 piksel. Duke përdorur rafinimin CTF për grimcë, korrigjimin e lëvizjes për grimcë dhe raundin e dytë të rafinimit CTF për grimcë, rafinimi 3D, maskimi i tretësit dhe përpunimi pasues kryhen pas çdo hapi për të rafinuar më tej teksturën që rezulton. Duke përdorur vlerën prerëse të FSC (Koeficienti i Korrelacionit të Shellit Fourier) prej 0.143, rezolucionet e modeleve përfundimtare të RC-LH114-W dhe RC-LH116 janë përkatësisht 2.65 dhe 2.80 Å. Kurba FSC e modelit përfundimtar tregohet në Figurën 2. S17.
Të gjitha sekuencat e proteinave janë shkarkuar nga UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) u përdor për të ndërtuar një model homologjie të RC, i cili përmban sekuencat e proteinave të RC-L, RC-M dhe RC-H dhe struktura kristalore e Rba.sphaeroides RC u përdor si shabllon (PDB ID: 5LSE) (46). Përdorni mjetin "përshtatja e hartës" në UCSF Chimera për të përshtatur modelin e gjeneruar në hartë (47), për të përmirësuar strukturën e proteinave dhe për të shtuar kofaktorin [4×BChl a (emri i mbetjes së bibliotekës së monomerit = BCL), 2×BPh a (BPH), një ose dy lloje të UQ10 (U10), një hekur jo-hem (Fe) dhe një 3,4-dihidroheksakarbonilkolinë (QAK)]. Meqenëse QAK nuk është i disponueshëm në bibliotekën e monomerit, ai u parametrizua duke përdorur mjetin eLBOW në PHENIX (49).
Më pas, u ndërtua nën-njësia LH1. Fillimisht, mjeti automatik i ndërtimit në PHENIX (49) u përdor për të ndërtuar automatikisht një pjesë të sekuencës LH1 duke përdorur hartën dhe sekuencat e proteinave LH1-α dhe LH1-β si të dhëna hyrëse. Zgjidhni nën-njësinë më të plotë LH1, nxirreni atë dhe ngarkojeni në Coot, shtoni manualisht sekuencën që mungon në të dhe rafinoni manualisht të gjithë strukturën para se të shtoni dy BCls a (BCL) dhe një spiriloksantinë (CRT) [sipas dendësisë përkatëse Rps të kompleksit LH1 dhe përmbajtjes së njohur të karotenoideve. Speciet (17)]. Kopjoni nën-njësinë e plotë LH1 dhe përdorni "Docking Map Tool" të UCSF Chimera për të ankoruar në zonën ngjitur jo-model të dendësisë LH1 dhe më pas rafinojeni atë në Coot; përsëriteni procesin derisa të jenë modeluar të gjitha nën-njësitë LH1. Për strukturën RC-LH114-W, duke nxjerrë dendësinë e paalokuar në Coot, proteina segmentohet nga përbërësit e mbetur jo-proteina në hartën USCF Chimera dhe mjeti Autobuild përdoret për të krijuar modelin fillestar dhe modelimin e nënnjësive të mbetura (proteina-W). Në PHENIX (49). Shtoni çdo sekuencë që mungon në modelin që rezulton në Coot (48) dhe më pas rafinoni manualisht të gjithë nënnjësinë. Dendësia e mbetur e paalokuar përputhet me kombinimin e lipideve (ID e bibliotekës së monomerit PDB të CDL = CDL, POPC = 6PL dhe POPG = PGT), detergjentit β-DDM (LMT) dhe molekulave UQ10 (U10). Përdorni optimizimin PHENIX (49) dhe optimizimin manual në Coot (48) për të përsosur modelin fillestar të plotë derisa statistikat e modelit dhe cilësia vizuale e përshtatjes të mos mund të përmirësohen më tej. Së fundmi, përdorni LocScale (50) për të mprehur hartën lokale dhe më pas kryeni disa cikle të tjera të modelimit të dendësisë së paalokuar dhe optimizimit automatik dhe manual.
Peptidet, kofaktorët dhe lipidet e kinonet e tjera përkatëse të ankoruara brenda dendësive të tyre përkatëse tregohen në Figurat 1 dhe 2. S18 deri në S23. Informacioni statistikor i modelit përfundimtar tregohet në Tabelën S1.
Nëse nuk specifikohet ndryshe, spektrat e absorbimit UV/Vis/NIR u mblodhën në një spektrofotometër Cary60 (Agilent, SHBA) në intervale 1 nm nga 250 nm në 1000 nm dhe një kohë integrimi prej 0.1s.
Holloni mostrën në një kuvetë kuarci me një shteg prej 2 mm deri në A880 prej 1 dhe mblidhni spektrin e absorbimit midis 400 dhe 1000 nm. Spektrat dikroikë rrethorë u mblodhën në një spektropolarimetër Jasco 810 (Jasco, Japoni) në intervale 1 nm midis 400 nm dhe 950 nm me një shpejtësi skanimi prej 20 nm min-1.
Koeficienti i shuarjes molare përcaktohet duke holluar kompleksin bazë në një A880 prej afërsisht 50. Holloni vëllimin prej 10 μl në 990 μl tampon lidhës ose metanol dhe mblidhni menjëherë spektrin e absorbimit për të minimizuar degradimin e BChl. Përmbajtja e BChl e secilës mostër metanoli u llogarit nga koeficienti i shuarjes në 771 nm prej 54.8 mM-1 cm-1, dhe koeficienti i shuarjes u përcaktua (51). Pjesëtoni përqendrimin e matur të BChl me 32 (RC-LH114-W) ose 36 (RC-LH116) për të përcaktuar përqendrimin e kompleksit bazë, i cili më pas përdoret për të përcaktuar spektrin e absorbimit të të njëjtës mostër të mbledhur në tampon paralel. U morën tre matje të përsëritura për secilën mostër dhe për llogaritjen u përdor thithja mesatare e maksimumit BChl Qy. Koeficienti i shuarjes së RC-LH114-W i matur në 878 nm është 3280±140 mM-1 cm-1, ndërsa koeficienti i shuarjes së RC-LH116 i matur në 880 nm është 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 u përcaktua sipas metodës në (52). Shkurt, HPLC me fazë të kundërt (RP-HPLC) u krye duke përdorur sistemin Agilent 1200 HPLC. Tretni rreth 0.02 nmol RC-LH116 ose RC-LH114-W në 50μl metanol:kloroform 50:50 që përmban 0.02% (w/v) klorur ferrik, dhe injektoni Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm të para-ekuilibruar. Tretni në 1 ml-1 min-1 në 40°C në tretës HPLC (metanol 80:20:2-propanol) në një kolonë ×25 cm. Kryeni elucion izokratik në një tretës HPLC për të monitoruar thithjen në 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoide) dhe 780 nm (BChl) për 1 orë. Piku në kromatogramin 275 nm në 25.5 minuta u integrua, i cili nuk përmbante asnjë përbërës tjetër të dallueshëm. Sipërfaqja e integruar përdoret për të llogaritur sasinë molare të UQ10 të nxjerrë duke iu referuar kurbës së kalibrimit të llogaritur nga injektimi i standardeve të pastra nga 0 në 5.8 nmol (Figura S14). Çdo mostër u analizua në tre përsëritje, dhe gabimi i raportuar korrespondon me SD të mesatares.
Një tretësirë ​​që përmbante kompleksin RC-LH1 me një përthithje maksimale Qy prej 0.1 u përgatit me 30 μM citokrom c2 të zemrës së kalit të reduktuar (Merck, UK) dhe 0 deri në 50 μMUQ2 (Merck, UK). Tre mostra 1 ml u përgatitën në secilin përqendrim UQ2 dhe u inkubuan gjatë natës në errësirë ​​në 4°C për të siguruar përshtatje të plotë me errësirën para matjes. Tretësira u ngarkua në një spektrofotometër modular OLIS RSM1000 të pajisur me një rrjetë flakë/vijë 300 nm, hyrje 1.24 mm, prerje në mes 0.12 mm dhe dalje 0.6 mm. Një filtër kalimi me gjatësi 600 nm vendoset në hyrje të fototubit të mostrës dhe tubit të fotoshumëzuesit referues për të përjashtuar dritën e ngacmimit. Përthithja u monitorua në 550 nm me një kohë integrimi prej 0.15 s. Drita e ngacmimit emetohet nga LED (Diodë Emitting Light) M880F2 880 nm (Thorlabs Ltd., UK) përmes një kablli me fibra optike me intensitet 90% përmes një kontrolluesi DC2200 (Thorlabs Ltd., UK) dhe emetohet në burimin e dritës në një kënd prej 90°. Rrezja matëse është e kundërta e pasqyrës për të kthyer çdo dritë që nuk është absorbuar fillimisht nga mostra. Monitoroni thithjen 10 s para ndriçimit prej 50 s. Pastaj thithja u monitorua më tej për 60 s në errësirë ​​për të vlerësuar shkallën në të cilën kinololi redukton spontanisht citokromin c23+ (shih Figurën S8 për të dhëna të papërpunuara).
Të dhënat u përpunuan duke përshtatur një shpejtësi fillestare lineare brenda 0.5 deri në 10 s (në varësi të përqendrimit të UQ2) dhe duke mesatarizuar shpejtësitë e të tre mostrave në secilin përqendrim të UQ2. Përqendrimi RC-LH1 i llogaritur nga koeficienti përkatës i zhdukjes u përdor për të kthyer shpejtësinë në efikasitetin katalitik, të paraqitur në Origin Pro 2019 (OriginLab, SHBA), dhe të përshtatur me modelin Michaelis-Menten për të përcaktuar vlerat e dukshme Km dhe Kcat.
Për matjet e absorbimit kalimtar, mostra RC-LH1 u hollua në ~2μM në tampon IMAC që përmbante 50 mM askorbat natriumi (Merck, SHBA) dhe 0.4 mM Terbutin (Merck, SHBA). Acidi askorbik përdoret si një dhurues elektronesh sakrifikuese, dhe tert-butaklofeni përdoret si një frenues QB për të siguruar që dhuruesi kryesor RC të mbetet i reduktuar (domethënë, jo i fotooksiduar) gjatë gjithë procesit të matjes. Përafërsisht 3 ml mostër shtohet në një qelizë rrotulluese të personalizuar (rreth 0.1 m në diametër, 350 RPM) me një gjatësi shtegu optik prej 2 mm për të siguruar që mostra në shtegun e lazerit të ketë kohë të mjaftueshme për përshtatje në errësirë ​​midis pulseve të ngacmimit. Përdorni pulse lazeri ~100-fs për të amplifikuar sistemin lazer Ti: Sapphire (Spectra Physics, SHBA) për të ngacmuar mostrën në 880 nm me një shpejtësi përsëritjeje prej 1 kHz (20 nJ për NIR ose 100 nJ për Vis). Para mbledhjes së të dhënave, ekspozojeni mostrën ndaj dritës së ngacmimit për rreth 30 minuta. Ekspozimi do të shkaktojë inaktivizimin e QA (ndoshta duke e zvogëluar QA një ose dy herë). Por ju lutemi vini re se ky proces është i kthyeshëm sepse pas një periudhe të gjatë adaptimi në errësirë, RC do të kthehet ngadalë në aktivitetin e QA. Një spektrometër Helios (Ultrafast Systems, SHBA) u përdor për të matur spektrat kalimtarë me një kohë vonese prej -10 deri në 7000 ps. Përdorni softuerin Surface Xplorer (Ultrafast Systems, SHBA) për të çgrupuar grupet e të dhënave, pastaj bashkoni dhe standardizoni. Përdorni paketën e softuerit CarpetView (Light Conversion Ltd., Lituani) për të përdorur grupin e të dhënave të kombinuara për të marrë spektra diferenciale që lidhen me zbërthimin, ose përdorni një funksion që bashkon eksponentë të shumtë me përgjigjen e instrumentit për t'iu përshtatur evolucionit spektral me gjatësi vale të vetme në Origin (OriginLab, SHBA).
Siç u përmend më sipër (53), u përgatit një film fotosintetik që përmbante kompleksin LH1 që i mungonte si RC ashtu edhe antena periferike LH2. Membrana u hollua në 20 mM tris (pH 8.0) dhe më pas u ngarkua në një kuvetë kuarci me një shteg optik 2 mm. Një impuls lazeri 30nJ u përdor për të ngacmuar mostrën në 540 nm me një kohë vonese prej -10 deri në 7000 ps. Përpunoni të dhënat siç përshkruhet për mostrën Rps.pal.
Membrana u peletua me anë të centrifugimit në 150,000 RCF për 2 orë në 4°C, dhe më pas thithja e saj në 880 nm u resuspendua në 20 mM tris-HCl (pH 8.0) dhe 200 mM NaCl. Treteni membranën duke e përzier ngadalë në 2% (w/v) β-DDM për 1 orë në errësirë ​​në 4°C. Mostra u hollua në 100 mM karbonat trietilamoniumi (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) në një përqendrim proteine ​​prej 2.5 mg ml-1 (analiza Bio-Rad). Përpunimi i mëtejshëm u krye nga metoda e publikuar më parë (54), duke filluar me hollimin e 50 μg proteine ​​në një total prej 50 μl TEAB që përmban 1% (w/v) laurat natriumi (Merck, UK). Pas sonifikimit për 60 s, u reduktua me 5 mM tris(2-karboksietil)fosfinë (Merck, UK) në 37°C për 30 minuta. Për S-alkilim, inkuboni mostrën me 10 mM metil S-metiltiometansulfonat (Merck, UK) dhe shtojeni atë nga një tretësirë ​​​​stoku izopropanoli 200 mM për 10 minuta në temperaturë ambienti. Tretja proteolitike u krye duke shtuar 2 μg përzierje tripsinë/endoproteinazë Lys-C (Promega UK) dhe u inkubua në 37°C për 3 orë. Surfaktanti laurat u nxor duke shtuar 50 μl acetat etil dhe 10 μl acid trifluoroacetik të gradës LC 10% (v/v) (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) dhe duke e përzier me vorteks për 60 s. Ndarja e fazave u nxit me centrifugim në 15,700 RCF për 5 minuta. Sipas protokollit të prodhuesit, një kolonë spin C18 (Thermo Fisher Scientific, UK) u përdor për të aspiruar dhe çkripur me kujdes fazën e poshtme që përmbante peptidin. Pas tharjes me anë të centrifugimit në vakum, mostra u tret në 0.5% TFA dhe 3% acetonitril, dhe 500 ng u analizuan me anë të kromatografisë nanoflow RP të shoqëruar me spektrometri masive duke përdorur parametrat e sistemit të detajuar më parë.
Përdorni MaxQuant v.1.5.3.30 (56) për identifikimin dhe përcaktimin sasior të proteinave për të kërkuar bazën e të dhënave të proteomeve Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Të dhënat e proteomikës së spektrometrisë masive janë depozituar në Alliance ProteomeXchange përmes depozitës partnere PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) nën identifikuesin e të dhënave PXD020402.
Për analizën me RPLC të shoqëruar me spektrometrinë masive të jonizimit me elektrospërkatje, kompleksi RC-LH1 u përgatit nga Rps i tipit të egër. Duke përdorur metodën e publikuar më parë (16), përqendrimi i proteinës së prodhuar në qelizat palustris ishte 2 mg ml-1 në 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl dhe 0.03% (w/v) β- (analiza Bio-Rad) ) DDM. Sipas protokollit të prodhuesit, përdorni kitin e pastrimit 2D (GE Healthcare, SHBA) për të nxjerrë 10 μg proteinë me metodën e reshjes dhe tretni precipitatin në 20 μl 60% (v/v) acid formik (FA), 20% (v/v) Acetonitril dhe 20% (v/v) ujë. Pesë mikrolitra u analizuan me RPLC (Dionex RSLC) të shoqëruar me spektrometrinë masive (Maxis UHR-TOF, Bruker). Përdorni kolonën MabPac 1.2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, UK) për ndarje në 60°C dhe 100μlmin -1, me një gradient prej 85% (v/v) tretësirë ​​A [0.1% (v/v) FA dhe 0.02% (V/v) tretësirë ​​ujore TFA] në 85% (v/v) tretës B [0.1% (v/v) FA dhe 0.02% (v/v) në 90% (v/v) acetonitril TFA]. Duke përdorur burimin standard të jonizimit me elektrospërkatje dhe parametrat e paracaktuar për më shumë se 60 minuta, spektrometri i masës merr 100 deri në 2750 m/z (raporti masë-ngarkesë). Me ndihmën e mjetit FindPept të portalit të burimeve bioinformatike ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/), hartëzoni spektrin e masës në nënnjësitë e kompleksit.
Qelizat u rritën për 72 orë nën 100 ml dritë NF-të ulët (10μMm-2 s-1), mesatare (30μMm-2 s-1) ose të lartë (300μMm-2 s-1). Mjedis M22 (mjedis M22 në të cilin sulfati i amonit është hequr dhe suksinati i natriumit është zëvendësuar me acetat natriumi) në një shishe 100 ml me kapak vidhosës (23). Në pesë cikle 30-s, sferat e qelqit 0.1 mikron u formuan në një raport vëllimi prej 1:1 për të lizuar qelizat dhe u ftohën në akull për 5 minuta. Lënda e patretshme, qelizat e pathyera dhe sferat e qelqit u hoqën me anë të centrifugimit në 16,000 RCF për 10 minuta në një mikrocentrifug të vendosur në tavolinë. Membrana u nda në një rotor Ti 70.1 me 100,000 RCF në 20 mM tris-HCl (pH 8.0) me një gradient saharoze 40/15% (p/p) për 10 orë.
Siç përshkruhet në punën tonë të mëparshme, imunodetektimi i etiketës His në PufW (16). Shkurt, kompleksi i bërthamës së pastruar (11.8 nM) ose membrana që përmban të njëjtin përqendrim të RC (i përcaktuar nga oksidimi duke zbritur spektrin e ndryshimit të reduktuar dhe duke përputhur ngarkesën në xhelin e ngjyrosur) në tampon ngarkimi 2x SDS (Merck, UK) të holluar dy herë. Proteinat u ndanë në një xhel NuPage replikë 12% bis-tris (Thermo Fisher Scientific, UK). Një xhel u ngjyros me Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) për të ngarkuar dhe vizualizuar nën-njësinë RC-L. Proteina në xhelin e dytë u transferua në membranën e fluorurit të polivinilidenit të aktivizuar me metanol (PVDF) (Thermo Fisher Scientific, UK) për imunoanalizë. Membrana PVDF u bllokua në 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v/v) Tween-20 dhe 5% (w/v) pluhur qumështi të skremuar, dhe më pas u inkubua me antitrupin primar anti-His (në hollimin e tamponit të antitrupave [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl dhe 0.05% (v/v) Tween-20] në 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, SHBA) për 4 orë. Pas larjes 3 herë për 5 minuta në tampon antitrupash, membrana u kombinua me antitrup sekondar anti-mi të peroksidazës së rrikës (Sigma-Aldrich, UK) (i holluar 1:10,000 në tampon antitrupash). Inkubohet për të lejuar zbulimin (5 minuta pas 3 larjeve në tampon antitrupash) duke përdorur substratin e kemilumineshencës WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Itali) dhe Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK).
Duke vizatuar shpërndarjen e intensitetit të secilës xhel të ngjyrosur ose korsi imunoanalize, duke integruar zonën nën kulmin dhe duke llogaritur raportin e intensitetit të RC-L (xhel i ngjyrosur) dhe Protein-W (imunoanalizë), në ImageJ (57) Përpunoni imazhin. Këto raporte u konvertuan në raporte molare duke supozuar se raporti i RC-L me protein-W në mostrën e pastër RC-LH114-W ishte 1:1 dhe duke normalizuar të gjithë të dhënat në përputhje me rrethanat.
Për materiale shtesë për këtë artikull, ju lutemi shihni http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Ky është një artikull me akses të hapur i shpërndarë sipas kushteve të Licencës së Attributionit Creative Commons. Artikulli lejon përdorim, shpërndarje dhe riprodhim të pakufizuar në çdo medium me kusht që vepra origjinale të citohet siç duhet.
Shënim: Ne ju kërkojmë vetëm të jepni adresën tuaj të email-it në mënyrë që personi që ju rekomandoni në faqe të dijë se ju dëshironi që ai ta shohë email-in dhe se nuk është spam. Ne nuk do të kapim asnjë adresë email-i.
Kjo pyetje përdoret për të testuar nëse jeni vizitor dhe për të parandaluar dërgimin automatik të spam-it.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Struktura me rezolucion të lartë e kompleksit të kurthit të dritës 1 në qendrën e reagimit ofron njohuri të reja mbi dinamikën e kinoneve.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Struktura me rezolucion të lartë e kompleksit të kurthit të dritës 1 në qendrën e reagimit ofron njohuri të reja mbi dinamikën e kinoneve.
©2021 Shoqata Amerikane për Avancimin e Shkencës. të gjitha të drejtat e rezervuara. AAAS është partner i HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dhe COUNTER. Shkenca përparon ISSN 2375-2548.